[发明专利]一种果上叶DNA的提取方法

说明书

本发明属于植物DNA提取的技术领域，具体涉及一种果上叶DNA的提取方法，包括步骤：(1)将果上叶置于聚丙烯酰胺溶液中搅拌10‑20min，取出冲洗，表面喷洒非离子表面活性剂溶液，再经液氮速冻后，研磨成粉末；(2)向粉末中加DNA提取溶液进行水浴提取；(3)加抽提溶液混匀，离心，取上清液A；(4)向上清液A中加氯仿/异戊醇混合物混匀，离心，取上清液B；(5)向上清液B中加无水乙醇混匀，静置、离心，析出沉淀、水洗；本发明方法具有DNA提取率高、杂质少的特点，符合后续DNA分子学鉴定的要求。

技术领域

本发明属于植物DNA提取的技术领域，具体涉及一种果上叶DNA的提取方法。

背景技术

果上叶为《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003版)收载品种，来源于兰科植物云南石仙桃Pholidota yunnanensis Rolfe的干燥根状茎和假鳞茎，具有养阴清肺，化痰止咳，行气止痛之功效，用于肺结核咳嗽、咯血，慢性气管炎，慢性咽炎，疝气疼痛，疮疡肿痛等症。

目前从收集的果上叶野生资源来看，其具有复杂的多样性，仅从形态鉴定来说，难以对其准确鉴定，因此，采用生物学鉴定能够提高鉴定的准确性，而现有的DNA提取方法，所得的DNA质量不优，难以满足后续鉴定。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提出了一种果上叶DNA的提取方法。

具体是通过以下技术方案来实现的：

一种果上叶DNA的提取方法，包括如下步骤：

(1)按照1：(1.3-1.8)的料液质量比将果上叶置于聚丙烯酰胺溶液中搅拌10-20min，取出冲洗1-2次后，表面喷洒果上叶质量0.1-0.5％的非离子表面活性剂溶液，再经液氮速冻后，研磨成粉末；

(2)将果上叶粉末倒入冷的EP管内，并加入预热至水浴温度的DNA提取溶液，摇匀后水浴30-60min，在水浴期间来回颠倒3-5次；

(3)取出EP管冷却至室温后，加入抽提溶液充分颠倒混匀，12000×g离心5min，取上清液A；所述抽提溶液与DNA提取溶液的体积比为1:1；

(4)将上清液A转入新EP管中，加入氯仿/异戊醇混合物充分颠倒混匀，12000×g离心5min，取上清液B；所述氯仿/异戊醇混合物与上清液A的体积比为1:1；

(5)取上清液B转移到新离心管中，加入0.8-1倍体积的预冷无水乙醇充分颠倒混匀，再静置于-20℃下10-20min，再12000×g离心10min，使DNA充分析出得到DNA沉淀；

(6)水洗DNA沉淀1-2次。

所述聚丙烯酰胺溶液的体积浓度为10-30％。

所述非离子表面活性剂溶液的体积浓度为40-50％。

所述非离子表面活性剂选吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、司盘-20、司盘-80中任一种。

所述DNA提取溶液为2-3％CTAB，0.08％-0.1％(V/V)β-巯基乙醇，0.01％-0.04％阴离子表面活性剂，1.1-1.3mol/LNaCl。

所述阴离子表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠。

所述抽提溶液为苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1的混合物。

所述水浴温度为55-60℃。

所述氯仿/异戊醇混合物为按体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合物。

所述预冷无水乙醇的温度为5-10℃。

有益效果：