[发明专利]一种引物组合物、试剂盒和应用

权利要求书

1.一种引物组合物，包括正向引物和反向引物；其中，所述正向引物的序列如SEQ IDNO:1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的引物组合物在鉴定金银花及其混伪品中的应用；其中，所述混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。

3.一种采用权利要求1所述的引物组合物鉴定金银花及其混伪品的方法，其特征在于，包括步骤：

提取待测样品的总DNA；

采用所述引物组合物，以所述待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；

对扩增产物进行测序，获得ASV序列；

将所述ASV序列与金银花及其混伪品的psbA-trnH区域内相应基因序列进行比对，鉴定出金银花及其混伪品；其中，所述混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系中包括：0.1-0.3μmol/L正向引物；0.1-0.3μmol/L反向引物；2-10ng/μL模板DNA；50-150μmol/L dNTPs；0.02-0.03U/μL DNA聚合酶。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件包括：预变性：97-98℃，50-70s；变性：97-98℃，8-12s；退火：54-56℃，13-17s；延伸：67-69℃，25-35s；35-45个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6min。

6.一种采用权利要求1所述的引物组合物定量鉴定金银花及其混伪品的方法，其特征在于，包括步骤：

提取待测样品的总DNA；

采用所述引物组合物，以所述待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；

对扩增产物进行测序，获得ASV序列；

将所述ASV序列与金银花及其混伪品的psbA-trnH区域内相应基因序列进行比对，鉴定出金银花及其混伪品；其中，所述混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种；

分别统计所述金银花和所述混伪品对应的ASV序列数目，然后经过换算得到所述金银花和所述混伪品的质量比值。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系中包括：0.1-0.3μmol/L正向引物；0.1-0.3μmol/L反向引物；2-10ng/μL模板DNA；50-150μmol/L dNTPs；0.02-0.03U/μL DNA聚合酶。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件包括：预变性：97-98℃，50-70s；变性：97-98℃，8-12s；退火：54-56℃，13-17s；延伸：67-69℃，25-35s；35-45个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6min。

9.一种用于鉴定金银花及其混伪品的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述的引物组合物；其中，所述混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、DEPC水、DNA聚合酶、dNTPs，及操作说明书。