[发明专利]一种引物组合物、试剂盒和应用

说明书

本申请涉及植物鉴定技术领域，提供了一种引物组合物、试剂盒和应用。引物组合物包括正向引物和反向引物；其中，正向引物的序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。本申请提供的引物组合物，可以用于特异性扩增金银花、灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花的psbA‑trnH区域内特定序列，从而准确鉴定出金银花中是否掺有灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花或淡红忍冬的花。

本申请要求于2021年09月02日提交中国专利局、申请号为202111027244.5、发明名称为“一种引物组合物、试剂盒和应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本申请涉及植物鉴定技术领域，特别是涉及一种引物组合物、试剂盒和应用。

背景技术

金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)干燥花蕾或待初开的花，为我国常用大宗药材之一。忍冬科植物灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides)、红腺忍冬(Lonicera hypoglauca)、华南忍冬(Lonicera confuse)或黄褐毛忍冬(Lonicerafulvotomentosa)的干燥花蕾或待初开的花统称为山银花。淡红忍冬(Loniceraacuminata)的花是另一种忍冬科忍冬属植物的干燥花蕾或待初开的花。

在中药材市场上，金银花价格较高，导致中成药金银花成分中掺伪的情况较为严重，比如掺有灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花或淡红忍冬的花等。由于这些物种的花的形状特征比较相似，加上中成药中添加的成分往往经过蒸煮、研磨、提取等工序，添加成分已失去原有性状特征，导致采用常规方法鉴定时，容易受到主观影响而判断不准确。因此，亟需一种更加客观准确的鉴定金银花中是否掺有混伪品的方法。

发明内容

本申请的目的在于提供一种引物组合物，以通过对金银花及其混伪品中psbA-trnH区域内特定序列的特异性扩增，从而实现金银花及其混伪品的准确鉴定。具体技术方案如下：

本申请提供了一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。

本申请还提供了上述引物组合物在鉴定金银花及其混伪品中的应用；其中，混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。

本申请还提供了一种采用上述引物组合物鉴定金银花及其混伪品的方法，包括步骤：提取待测样品的总DNA；采用引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；对扩增产物进行测序，获得ASV序列；将ASV序列与金银花及其混伪品的psbA-trnH区域内相应基因序列进行比对，鉴定出金银花及其混伪品；其中，混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。

在一些实施例中，PCR扩增体系中包括：0.1-0.3μmol/L正向引物；0.1-0.3μmol/L反向引物；2-10ng/μL模板DNA；50-150μmol/L dNTPs；0.02-0.03U/μL DNA聚合酶。

在一些实施例中，PCR扩增的条件包括：预变性：97-98℃，50-70s；变性：97-98℃，8-12s；退火：54-56℃，13-17s；延伸：67-69℃，25-35s；35-45个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6min。