[发明专利]一种鉴别大黄药材三个基原物种的方法与应用

说明书

本发明涉及大黄药材三个基原物种的鉴别及其应用，具体包括基于叶绿体基因组筛选高变区，以筛选的高变区rps16‑trnQ、psaA‑ycf3、psbE‑petL、ndhF‑rpl32与trnT‑trnL序列为模板设计引物1F/1R、2F/2R、3F/3R、4F/4R和5F/5R，并对42份样本进行PCR扩增，Sanger测序后利用MEGA7.0评价所筛选序列的物种鉴定能力，确定能够用于鉴定唐古特大黄、药用大黄与掌叶大黄的特异DNA条形码。本发明公开可有效扩增高变区rps16‑trnQ、psaA‑ycf3、psbE‑petL、ndhF‑rpl32与trnT‑trnL的5对通用引物，可用于大黄药材三个基原物种原植物、种子及药材的鉴定，为大黄药材三个基原物种分类鉴定、保证大黄药材临床用药安全及规范大黄药材市场提供依据。

技术领域

本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及基于叶绿体基因组开发鉴别大黄药材三个基原物种的特异DNA条形码。

背景技术

《中国药典》收载药材大黄Rhei Radix et Rhizoma为蓼科植物掌叶大黄Rheumpalmatum L.、唐古特大黄Rh.tanguticum Maxim.ex Balf.和药用大黄Rh.officinaleBaill.的干燥根及根茎。大黄具有广泛药效作用主要与其含有大量活性成分有关，大黄主要化学成分为蒽醌类、蒽酮类、二苯乙烯类、鞣质类等化合物。不同基原的大黄药材在化学物质上存在差别，在不同功效上表现出专长，研究表明掌叶大黄专长于“清热泻火、利湿退黄”，而唐古特大黄专长于“泻下攻积、逐瘀通经”。因此大黄基原物种鉴别对于大黄临床精准用药具有重要意义。

大黄基原物种鉴定方法主要有性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定(HPLC、UPLC等)及DNA条形码(ITS2、psbA-trnH及matK等)。大黄药材三个基原物种区别主要在于叶片分裂程度，药用大黄掌状浅裂，呈大齿形或宽三角形；掌叶大黄叶片浅裂至半裂，呈较窄三角形；唐古特大黄叶深裂，裂片狭长呈三角状披针形或狭长形。性状和显微鉴定对大黄基原植物或药材特征的完整性要求较高，鉴别过程需依靠长期经验积累，且经过深加工的大黄饮片及中成药，形态特征破坏会增加基原物种鉴定难度。理化鉴定依据中药材主要成分进行鉴定，但操作较为繁琐。与传统鉴定方法相比，DNA分子能为物种鉴定提供丰富信息，通过ITS2、psbA-trnH及matK等DNA条形码能够有效鉴别正品大黄与华北大黄Rh.franzenbachiiMunt.、河套大黄Rh.hotaoense C.Y.Cheng et Kao等混伪品，但难以精确到基原物种。与传统DNA条形码相比，叶绿体基因组具有更丰富变异位点和更强物种分辨率，因此可基于叶绿体基因组高变区开发有效鉴别唐古特大黄、掌叶大黄和药用大黄的特异DNA条形码，以期用于大黄基原植物、药材、饮片及相关中成药的基原鉴定。

发明内容

本发明第一个目的是筛选大黄药材三个基原物种叶绿体基因组高变区，开发有效鉴别唐古特大黄、掌叶大黄和药用大黄的特异DNA条形码。

本发明第二个目的是以筛选的高变区序列为模板设计引物，提供用于鉴别大黄药材三个基原物种的5对引物，记为1F/1R、2F/2R、3F/3R、4F/4R和5F/5R，本发明所述引物的核苷酸序列如下表1所示：

表1用于鉴别大黄药材三个基原物种的5对引物

本发明提供的大黄药材三个基原物种鉴别方法，包括如下步骤：

步骤1.大黄药材三个基原物种特异DNA条形码的筛选；

应用mVISTA对唐古特大黄、药用大黄、掌叶大黄叶绿体基因组进行全局比对分析，利用DnaSP软件检测3条叶绿体基因组的核苷酸变异程度(Pi)，最后以筛选的高变区序列为模板设计引物。

步骤2.大黄药材三个基原物种特异DNA条形码的获得；