[发明专利]增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法

权利要求书

1.一种提高安丝菌素发酵水平的方法，其特征在于，在珍贵束丝放线菌中增强表达安丝菌素体内靶标蛋白基因，获得安丝菌素高产菌株，发酵获得安丝菌素；所述靶标蛋白基因为基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765、APASM_6307中的一种或几种，其序列依次是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的提高安丝菌素发酵水平的方法，其特征在于，在珍贵束丝放线菌ATCC 31280中增强安丝菌素体内靶标蛋白基因具体包括如下步骤：

S1，设计并构建用于增强表达基因APASM_0666的整合型质粒I；

S2，设计并构建用于增强表达基因APASM_1807的整合型质粒II；

S3，设计并构建用于增强表达基因APASM_5765的整合型质粒Ш；

S4，设计并构建用于增强表达基因APASM_6307的整合型质粒IV；

S5，通过接合转移将整合型质粒I、II、Ш、IV分别导入受体菌株中，然后对突变株进行安普霉素抗性验证，并挑取菌丝体通过PCR产物片段大小的差异，筛选得到基因增强表达突变株。

3.如权利要求2所述的提高安丝菌素发酵水平的方法，其特征在于，所述整合型质粒I的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式分别从ATCC 31280基因组中获取882bp的APASM_0666基因片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点。

4.如权利要求2所述的提高安丝菌素发酵水平的方法，其特征在于，所述整合型质粒II的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式分别从ATCC 31280基因组中获取861bp的APASM_1807基因片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点。

5.如权利要求2所述的提高安丝菌素发酵水平的方法，其特征在于，所述整合型质粒Ш的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式分别从ATCC 31280基因组中获取729bp的APASM_5765基因片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点。

6.如权利要求2所述的提高安丝菌素发酵水平的方法，其特征在于，所述整合型质粒IV的具体构建方法是，通过PCR扩增的方式分别从ATCC 31280基因组中获取993bp的APASM_6307基因片段，通过酶切连接的方法连入整合型质粒pDR3-K*的NdeI/EcoRI位点。

7.如权利要求1所述的提高安丝菌素发酵水平的方法，其特征在于，所述发酵包含下列步骤：将活化后的安丝菌素体内靶标蛋白基因增强表达突变株菌丝体接种于一级种子培养基中，30℃、220rpm条件下培养24小时；按3.3％接种量转接至二级种子培养基中，30℃、220rpm的转速下培养24小时；按10％的接种量转接至发酵培养基中，25℃、220rpm的转速下发酵7天后收集发酵液并进行萃取。

8.如权利要求书7所述的提高安丝菌素发酵水平的方法，其特征在于，

所述一级种子培养基包括TSB 3w/v％、酵母提取物0.5w/v％、蔗糖10.3w/v％；

所述二级种子培养基包括TSB 3w/v％、酵母提取物0.8w/v％、蔗糖10.3w/v％、异丁醇0.05v/v％、异丙醇0.05v/v％；

所述发酵培养基包括酵母提取物1.6w/v％、麦芽提取物1w/v％、蔗糖10.3w/v％、淀粉2.5w/v％、异丁醇0.5v/v％、异丙醇1.2v/v％、MgCl₂ 2mmol/L。