[发明专利]增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法

说明书

本发明公开了一种增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法。通过在珍贵束丝放线菌ATCC 31280中，利用强启动子kasOp*分别增强表达安丝菌素体内靶标蛋白APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307，得到高产安丝菌素的突变株HQG‑01、HQG‑02、HQG‑03和HQG‑04。与出发菌株相比，本发明所得到的高产菌株HQG‑01、HQG‑02、HQG‑03和HQG‑04发酵产量分别提高了24.1％、66.5％、71.5％和93.5％，实验室摇瓶发酵水平分别达到57.1mg/L、76.6mg/L、78.9mg/L和89mg/L。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法；尤其涉及一种增强安丝菌素体内靶标蛋白基因的转录水平以提高安丝菌素发酵水平的方法；通过在珍贵束丝放线菌ATCC 31280中利用强启动子kasOp*增强表达内源的安丝菌素体内靶标蛋白基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307，可以提高珍贵束丝放线菌的生物量，降低其胞内毒性，解除相关合成酶的反馈抑制，最终可明显提高安丝菌素产量。

背景技术

安丝菌素是由珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)产生的一种大环内酰胺类抗生素，它能够与微管蛋白的β亚基结合，阻碍微管组装，从而抑制肿瘤细胞分裂。来自ImmunoGen，Inc.公司的Chari等人通过在C-3位酯链上连接二硫键形成DM1分子，经DTT还原后可与不同的抗体连接形成抗体-药物偶联物(ADC)。目前，衍生于安丝菌素的多种ADC药物已经进入不同的临床检定阶段，其中由罗氏公司开发的用于治疗人类乳腺癌的Trastuzumab Emtansine(即T-DM1)已经成药上市。除了抗肿瘤活性外，安丝菌素还能抑制真菌、酵母、昆虫等其它真核生物的生长与繁殖。

在安丝菌素的产生菌ATCC 31280的发酵过程中，安丝菌素会对细胞的生长和生理活动造成影响，此时，细胞的自身防护机制将会响应安丝菌素的进一步合成。通过化学蛋白质组学信息，我们找到了四个参与了安丝菌素合成相关的基因：APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307。增强安丝菌素体内靶标蛋白基因的表达可以提高产生菌的生物量，降低安丝菌素对宿主的毒性，解除对安丝菌素合成的抑制，最终提高安丝菌素的产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增强安丝菌素体内靶标蛋白基因表达的高产安丝菌素方法；本发明通过增强安丝菌素体内靶标蛋白基因的表达水平以提高安丝菌素发酵水平，获得的高产安丝菌素的突变菌株(HQG-01、HQG-02、HQG-03和HQG-04)，基于增强表达内源安丝菌素体内靶标蛋白基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765和APASM_6307，最终提高安丝菌素的产量。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一方面，本发明提供一种提高安丝菌素发酵水平的方法，在珍贵束丝放线菌中增强表达安丝菌素体内靶标蛋白基因，获得安丝菌素高产菌株，发酵获得安丝菌素；所述靶标蛋白基因为基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765、APASM_6307中的一种或几种，其序列依次是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

作为本发明的一个实施方案，所述珍贵束丝放线菌包括Actinosynnemapretiosum subsp.pretiosumATCC 31280。

进一步的，所述安丝菌素高产菌株由珍贵束丝放线菌ATCC 31280增强表达来源于珍贵束丝放线菌ATCC 31280的安丝菌素体内靶标蛋白基因APASM_0666、APASM_1807、APASM_5765或APASM_6307后获得。

作为本发明的一个实施方案，在ATCC 31280中增强表达安丝菌素体内靶标蛋白基因具体包括如下步骤：