[发明专利]一种微流控芯片及其制备方法与结合两步微球竞争法在C-反应蛋白检测中的应用

权利要求书

1.一种微流控芯片，其特征在于，包括位于顶部的PDMS芯片、中部的PDMS薄膜和底部的基板，所述PDMS芯片内设置有不同形状的微通道或微通道阵列、溶液出口和溶液进口，所述溶液进口位于微通道或微通道阵列起始端，所述溶液出口位于微通道或微通道阵列的末端；

所述PDMS薄膜厚度小于微球直径，所述PDMS薄膜上设置有一个圆孔；所述微通道或微通道阵列与PDMS薄膜形成封闭通道，通道末端覆盖在圆孔之上形成开口；所述溶液出口位于PDMS薄膜的圆孔部分；

所述微流控芯片在工作过程中，通过从溶液进口注入溶液后，溶液只能经微通道或微通道阵列从开口处流向圆孔处的出口，微球从通道末端开始堆积，形成可视化堆积线。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述基板采用的材料为玻璃或硅片。

3.一种根据权利要求1或2任一项所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）PMMA阴模的制备：通过传统机加工方式制备得到微通道或微通道阵列的PMMA阴模；

（2）PDMS阳模的制备：将PDMS浇注到步骤（1）得到的PMMA阴模上，抽真空使PDMS填满孔隙、不留气泡；进行烘干处理，使浇注到PMMA阴模中的PDMS固化成型，将PDMS从PMMA阴模中脱出得到有凸起的微通道或微通道阵列的PDMS阳模；

（3）将步骤（2）中得到的PDMS阳模用等离子清洗机处理后，通过使用1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷进行化学气相沉积对其进行硅烷化，以便于后续PDMS之间的分离；

（4）微球堆积芯片的制备：将PDMS浇注到步骤（3）中硅烷化PDMS阳模上，抽真空使PDMS填满孔隙、不留气泡；进行烘干处理，使浇注到硅烷化PDMS阳模上的PDMS固化成型，将PDMS脱出得到有微通道或微通道阵列的PDMS芯片；

（5）PDMS薄膜的制备：取一光滑的圆盘置于高速匀胶机中央，在圆盘中心滴加少量PDMS，根据被堆积微球尺寸设定离心参数，匀胶后PDMS均匀涂覆在圆盘表面，烘干后得到PDMS薄膜；

（6）在步骤（4）中所得到的有微通道或微通道阵列的PDMS芯片上进行打孔，设置溶液出入口；

（7）在步骤（5）中所得到的PDMS薄膜上进行打孔，得到带有圆孔的PDMS薄膜；

（8）将步骤（6）设置有进出口和微通道或微通道阵列的PDMS芯片与步骤（7）中得到的带有圆孔的PDMS薄膜用等离子清洗机处理后键合；

（9）将步骤（8）中与PDMS薄膜粘合后的PDMS芯片与基板玻片用等离子清洗机处理后键合，得到可裸眼量化微球数量的微流控微球堆积芯片。

4.根据权利要求3所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，步骤（1）中的微通道或微通道阵列是任意形状、任意数量。

5.根据权利要求3所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，步骤（2）、步骤（4）和步骤（5）的烘干温度均为70℃；步骤（2）烘干时间为8 h，步骤（4）的烘干时间为8 h，步骤（5）的烘干时间为10 h。

6.根据权利要求3所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，步骤（3）、步骤（8）、步骤（9）中等离子清洗机处理的时间分别为5~10 min、1 min、1 min。

7.一种根据权利要求1或2任一项所述的微流控芯片结合两步微球竞争法在C-反应蛋白检测中的应用。

8.根据权利要求7所述的微流控芯片结合两步微球竞争法在C-反应蛋白检测中的应用，其特征在于，两步免疫微球竞争策略，具体包括以下步骤：

1）首先制备修饰有抗体的微球以及修饰有抗原的磁粒；

2）然后吸取包含有抗原的待检测样本与10%~90%体积的修饰有抗体的微球溶液混合培育反应；

3）再次往步骤2）中加入剩余的修饰有抗体的微球溶液并反应后，加入与微球溶液等体积的修饰有抗原磁粒并孵育；

4）最后磁分离步骤3）所获得的溶液去除结合有磁粒的免疫微球以及游离的纳米磁粒。

9.根据权利要求8所述的微流控芯片结合两步微球竞争法在C-反应蛋白检测中的应用，其特征在于，具体检测步骤如下：

步骤A.微球修饰抗体：将带羧基的微球与MES缓冲液混合均匀，与EDC和NHS活化反应后用PBS缓冲液清洗，重悬，加入抗体进行反应，再次用PBS缓冲液清洗后加入封闭液于4℃封闭过夜，之后重悬分散在PBS缓冲液中；

步骤B.磁粒修饰抗原：将带羧基的Fe₃O₄纳米磁粒与MES缓冲液混合，与EDC和NHS反应后用PBS缓冲液清洗三次，磁分离去除上清液；重悬，加入抗原避光反应，再次用PBS缓冲液清洗三次后，磁分离去除上清液后重悬分散在PBS缓冲液中；

步骤C.按两步免疫微球竞争策略孵育抗体修饰的微球、抗原修饰的磁粒以及待检测溶液；

步骤D.结合有游离抗原的微球复合物的捕获和堆积：步骤C完成后，吸取检测样本与微球-抗体混合孵育后将混匀样本注入微流控芯片溶液入口，溶液流经微通道后从出口处排出，微球则从通道末端开始堆积，形成可视条；

步骤E.数据读取：步骤D完成后，裸眼读取微球堆积长度，计算出所结合的抗原浓度，得到检测结果。