[发明专利]双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的获得方法，其特征在于，以人肝癌细胞MHCC97H为母细胞，利用奥沙利铂干预人肝癌细胞MHCC97H，奥沙利铂干预的初始剂量为2μM，使用浓度梯度法，直至奥沙利铂的浓度至40μM，使用CCK8法测定干预后细胞对于奥沙利铂IC50的变化，在干预后细胞获得了对奥沙利铂的稳定耐药性后，即为奥沙利铂耐药人肝癌细胞株。

2.根据权利要求1所述的一种奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的获得方法，其特征在于，奥沙利铂干预方式为：奥沙利铂干预的初始剂量为2μM，每个干预周期为96小时，使用浓度梯度法，浓度依次为2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM与40μM，直至奥沙利铂的浓度至40μM。

3.采用权利要求1-2中任一项所述方法获得的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株。

4.一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、荧光蛋白慢病毒的构建：利用HIV骨架慢病毒表达系统，构建红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白的慢病毒表达质粒，与HIV慢病毒包装试剂盒共转染，收获慢病毒颗粒后纯化，得到红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒；

B、目标细胞的感染：将步骤A中获得的红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒共转染权利要求3所述奥沙利铂耐药人肝癌细胞株；

C、双荧光奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的筛选：利用嘌呤毒素对感染后的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株进行筛选，然后通过荧光显微镜标记、挑选双荧光蛋白表达的细胞克隆；

D、双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的获得：将步骤C得到的双荧光蛋白表达的细胞扩增建系，获得双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株。

5.根据权利要求4所述一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的构建方法，其特征在于，步骤A中，所述红色荧光蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示；

所述绿色荧光蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

6.根据权利要求4所述一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的构建方法，其特征在于，步骤A中，构建红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白的慢病毒表达质粒，与HIV慢病毒包装试剂盒共转染后，使重组慢病毒质粒于293Ta包装细胞中增殖、被包装成为具有感染活性的慢病毒颗粒、并分泌进入细胞培养液，收获慢病毒颗粒后纯化，得到红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒。

7.根据权利要求4所述一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的构建方法，其特征在于，步骤B中，红色荧光蛋白慢病毒与绿色荧光蛋白慢病毒共转染比例为1:1。

8.根据权利要求4所述一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的构建方法，其特征在于，步骤C中，荧光显微镜观察条件为红色荧光蛋白的激发波长为587nm、发射波长为610nm；绿色荧光蛋白的激发波长为488nm，发射波长为507nm。

9.一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株，其特征在于，采用权利要求5-8任一所述方法构建得到。

10.一种如权利要求9所述双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株的应用，其特征在于，所述双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株用于制备肿瘤荧光示踪剂的应用。