[发明专利]双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及生物技术技术领域，尤其是涉及双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株及其构建与应用。本发明首先通过药物浓度递增系统建立奥沙利铂耐药人肝癌细胞株，并以其为母细胞，通过荧光蛋白重组质粒、慢病毒共感染细胞步骤，得到可稳定表达红色和绿色荧光的耐药人肝癌细胞系。使用本发明提供的耐药株建立、重组质粒和双荧光标记方法，可在同一个耐药肝癌细胞中共表达两种荧光。本发明的耐药人肝癌细胞可用于示踪肿瘤细胞的体内外研究、肝癌转移的分子机制研究，以及肝癌耐药机理与药疗评价研究等，有着广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术技术领域，尤其是涉及双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株及其构建方法与应用。

背景技术

众所周知，肝癌是异质性最强的实体肿瘤之一，不同致病机制加上异常复杂的时空异质性，致其治疗难度陡增；而且，随着时间的推移，尤其是在各种药物治疗背景下，肿瘤细胞多向演进，最终形成耐药。如何有效逆转耐药是目前肝癌乃至整个肿瘤治疗领域的热点，亦是肝癌患者获得长久有效持续应答的关键所在。目前，聚焦于推动肿瘤异质性转化研究面临巨大挑战，主要是因为研究人员难以理清肿瘤演进的思路，进而影响到设计和选择有效的治疗方案以应对出现的肿瘤耐药性。这不同于以往的任何耐药治疗理念，尤其具有独特性和新颖性，为进一步探究赋予肝癌细胞异质性的研究提供了一个良好的可控平台，这无疑将增强肿瘤学研究人员对肝癌细胞耐药行为的认知，也将为新型耐药逆转策略的制定提供理论依据。传统的肿瘤细胞荧光表达系统通常使用报告基因作为内参来减少实验的不可控因素；然而例如氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、葡萄醛酸糖苷酶等传统的共报告基因因各自的测试处理要求、检测特点存在差异往往不够便利；近年使用较多的萤火虫荧光素酶虽然避免了上述缺点，但是由于荧光素酶底物价格昂贵，需使用特殊仪器检测荧光素酶表达等因素限制了其使用范围。在医学研究领域引用的绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白由于具有荧光性质稳定、分子量小、对手提细胞基本无毒性、可行活细胞实时定位观察等优点，目前已被广泛用于肿瘤发生、生物学行为、血管生成、组织重构及治疗等肿瘤研究中。然而，在实际工作中，由于成像技术、光谱分析及电脑分析软件等配套设备与技术的限制，尚不能完全满足对单荧光示踪功能解读的需求。

发明内容

为了使双荧光组合在肿瘤与宿主的动态显像、肿瘤细胞演进以及耐药形成方面发挥更大的关键作用，本发明提供一种双荧光标记的奥沙利铂人肝癌细胞株及其构建方法与应用，即提供一种稳定表达mCherry与eGFP双荧光蛋白的奥沙利铂耐药人肝癌细胞株及相应的构建方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供一种奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的获得方法：

以人肝癌细胞MHCC97H为母细胞，利用奥沙利铂干预人肝癌细胞MHCC97H，奥沙利铂干预的初始剂量为2μM，使用浓度梯度法，直至奥沙利铂的浓度至40μM，使用CCK8法测定干预后细胞对于奥沙利铂IC50的变化，在干预后细胞获得了对奥沙利铂的稳定耐药性后，即为奥沙利铂耐药人肝癌细胞株，将其命名为MHCC97H-OXR细胞。

在本发明的一个实施方式中，奥沙利铂干预方式为：奥沙利铂干预的初始剂量为2μM，每个干预周期为96小时，随后，奥沙利铂的干预浓度上升至5μM，重复上述的步骤，直至奥沙利铂的浓度至40μM。

在本发明的一个实施方式中，奥沙利铂干预方式为：奥沙利铂干预的初始剂量为2μM，使用浓度梯度法，浓度依次为2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM与40μM。

在本发明的一个实施方式中，奥沙利铂耐药人肝癌细胞株的获得方法，具体包括以下步骤：

(1)人肝癌细胞株的前处理：利用含EDTA的胰蛋白酶消化人肝癌细胞MHCC97H，收集传代后使用PBS冲洗；

(2)建立奥沙利铂耐药人肝癌细胞株：利用不同浓度梯度的奥沙利铂干预步骤(1)得到的人肝癌细胞株，获得奥沙利铂耐药人肝癌细胞株。