[发明专利]基于常温原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用

说明书

本发明提供了一种基于常温原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用。具体地，本发明提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，该体系包含(a)向导ssDNA对；(b)常温Argonaute蛋白(Ago酶)，所述常温Argonaute蛋白(Ago酶)为以DNA为向导指导剪切靶标DNA的常温Argonaute蛋白(Ago酶)；(c)荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；其中，所述的靶标核酸分子为目标RNA。本发明的方法简便、兼容性好，可以广泛应用于感染性疾病如重大传染性和病原体感染性疾病(病毒、病原菌)检测领域等领域。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于常温原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用。

背景技术

核酸检测技术是主要通过靶核酸直接扩增或者结合其他信号放大技术，把微量核酸变成直观可读取信号的一系列技术的总称。被广泛应用于分子医学诊断、食品安全检测以及环境监测等诸多领域。尤其是助力精准医疗，包括病原体检测、基因分型、病程监测等方面，亟需开发灵敏高效的核酸检测技术。

综合现有核酸检测技术，除了测序、核酸印记及各种基于PCR技术的核酸检测方法外，还建立多种等温扩增技术的检测方法。由于等温扩增技术与其他的核酸扩增技术相比有快速、高效、特异的优点，且无需专用的设备，近年来在核酸检测领域得到了长足的发展。目前常见的恒温核酸扩增技术：环介导等温扩增技术(LAMP)、切口酶恒温扩增技术(NERA)、依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)、滚环扩增技术(RCA)、依赖解旋酶DNA等温扩增技术(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和酶促重组等温扩增技术(ERA)，皆可与下游检测技术相结合，发展新型核酸检测技术。然而，大多数现有技术在性能指标(如敏感性和特异性)方面都有折中。它们通常需要复杂的系统和繁琐的样品/试剂处理。

可编程性核酸结合蛋白因其可靶向定位于不同的基因序列，并能对目的序列进行特异性的结合和切割的特点，使得核酸检测技术的特异性进一步提高。基于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas 系统的核酸检测技术已被报道，基于Argonaute蛋白的核酸检测技术目前方兴未艾。

目前对于数量极其微少的待检测核酸RNA，摒弃耗时长，费用高，设计原理复杂等缺点，发展灵敏度高、特异性好、快速高效的核酸检测方法仍被迫切需要。

发明内容

本发明的目的就是提供一种对于数量极其微少的待检测核酸RNA，摒弃耗时长，费用高，设计原理复杂等缺点，发展灵敏度高、特异性好、快速高效的核酸检测方法。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，该体系包含：

(a)向导ssDNA对；

(b)常温Argonaute蛋白(Ago酶)，所述常温Argonaute蛋白(Ago酶)为以 DNA为向导指导剪切靶标DNA的常温Argonaute蛋白(Ago酶)；

(c)荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；

其中，所述的靶标核酸分子为目标RNA。

在另一优选例中，所述检测体系中，目标RNA经过反转录形成靶标DNA，被所述常温Argonaute蛋白(Ago酶)识别剪切。

在另一优选例中，所述常温Argonaute蛋白(Ago酶)具有以DNA为向导指导剪切靶标DNA的能力。

在另一优选例中，所述常温Argonaute蛋白(Ago酶)选自下组：Paenibacillusborealis(PbAgo)、Clostridium butyricum(CbAgo)、Kurthia massiliensis(KmAgo) 及其突变体。

在另一优选例中，所述的向导ssDNA对包括初级向导ssDNA和次级向导 ssDNA。