[发明专利]一种红松松塔抗肝细胞癌化合物筛选方法

说明书

本发明涉及抗肿瘤化合物筛选技术领域，具体涉及一种红松松塔抗肝细胞癌化合物筛选方法。包括以下几个步骤（1）原料预处理；（2）萃取；(3)浓缩干燥；(4)有机溶剂复溶；(5)正相硅胶柱层析，抗肝细胞癌活性跟踪；（6）正相硅胶介质中压制备液相柱层析，抗肝细胞癌活性跟踪；（7）反相硅胶介质中压制备液相柱层析，抗肝细胞癌活性跟踪；（8）结晶。本发明通过多级柱层析及抗肝细胞癌活性跟踪筛选红松松塔抗肝细胞癌化合物，能够获得高活性的抗肝细胞癌化合物，并可为红松松塔资源的综合利用提供参考。

技术领域

本发明涉及抗肿瘤化合物筛选技术领域，具体涉及一种红松松塔抗肝细胞癌化合物筛选方法。

背景技术

肝癌是一种进展快、转移迅速、致死率高的恶性肿瘤，其中，肝细胞癌是肝癌主要的组织学亚型。肝细胞癌的治疗以化疗为主，但是多数化疗药副作用大、价格昂贵，具有局限性。因此，寻找廉价高效的抗肝细胞癌化合物意义重大。红松广泛分布于我国东北部，资源丰富，其松子是具有多种生理活性的保健食品，采集松子后松塔通常被废弃，造成了资源浪费及环境污染。研究发现红松松塔醇提物具有良好的抗肝细胞癌活性，然而其准确的抗癌药效物质基础尚未有定论。目前尚未有对红松松塔抗肝细胞癌化合物系统性筛选的报道，且红松松塔抗肿瘤化合物的纯化多采硅胶柱层析，然而单一的纯化方法往往难以达到理想的效果。为此，利用多种纯化方法结合抗肝细胞癌活性跟踪，筛选红松松塔抗细胞癌化合物，具有一定的现实意义。

发明内容

本发明提供一种红松松塔抗肝细胞癌化合物筛选方法，能够高活性化合物，并可对肝细胞癌化疗药物的发掘及红松松塔资源的综合利用提供参考。

一种红松松塔抗肝细胞癌化合物筛选方法，包括以下步骤：

（1）原料预处理：取红松松塔整体放入烘干箱内50～60℃进行干燥，使含水量降至6%。将干燥后的红松松塔进行粉碎，过30～50目筛，得红松松塔粉末。

（2）萃取：将红松松塔粉末放入罐中，加入50～90%无水乙醇、甲醇做溶剂，料液比1/10～1/30；超声萃取2～3小时，超声功率300～500W，萃取温度70～85℃，获红松松塔萃取液。

（3）浓缩干燥：将萃取液进行减压浓缩，真空度0.075 MPa，温度70～85℃，浓缩至萃取液体积的1/30～1/20，回收乙醇；浓缩液真空冻干，冷阱温度-80～-60℃，真空度10～1Pa，得冻干物。

（4）复溶：冻干物加入5～20倍乙酸乙酯超声溶解，超声时间20～40分钟，超声功率200～300W，抽滤，浓缩，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯萃取物。

（5）正相硅胶柱层析：乙酸乙酯萃取物用质量比10～40倍的200～300目硅胶进行柱层析，以体积比7/1～15/1的氯仿/甲醇或二氯甲烷/甲醇进行等度层析，以1/5～1/2柱体积为单位收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥各组分。各冻干组分溶于DMSO中，加入无菌0.01 MPBS缓冲液，使DMSO最终浓度（V：V）为0.1～1％，制备供试液，并用MTT法筛选出对HepG2细胞活性抑制最强的组分。

（6）正相硅胶介质中压柱层析：将（5）中的正相硅胶筛选的对HepG2细胞毒性最大的组分复溶于氯仿或二氯甲烷中，进行正相硅胶介质柱层析，色谱条件如下：40 μm正相硅胶柱20 g，上样量0.1 g～1 g，流动相氯仿/甲醇（V：V，8/1～12/1）或二氯甲烷/甲醇（V：V，8/1～12/1），流速10 mL/min～25 mL/min，检测波长220 nm～250 nm，收集信号峰，浓缩，冻干，按（5）所述的MTT测试方法，筛选出对HepG2细胞毒性最高的组分。