[发明专利]一种检测血清中伏立康唑浓度的HPLC法

权利要求书

1.一种利用HPLC技术测定血清中伏立康唑浓度的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：取伏立康唑对照品，精密称定，加甲醇溶解并制成2mg·mL^-1的储备液，置4℃冷藏备用，精密量取储备液，分别加水稀释制成200、20和2μg·mL^-1的对照品溶液。

(2)内标溶液的制备：取尼莫地平对照品，精密称定，加甲醇溶解并制成1mg·mL^-1的内标储备液，精密量取储备液适量，加甲醇制成200μg·mL^-1的内标溶液。

(3)色谱条件：色谱柱：MerckSTARLP RP-18 endcapped(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈-水(53∶47，V/V)；流速1.0mL·min^-1；检测波长：256nm；柱温：35℃；进样量：50μL。

(4)血样处理：精密量取血清样品200，加入6μL内标溶液，涡旋震荡30秒，加入乙腈400μL，涡旋振荡2min，静置10min，11000r·min^-1离心10min，取上清液50μL，按步骤(3)，进样测定。

(5)标准曲线、最低检测限和定量限确定：取空白血清200μL 7份，分别对应加入20μg·mL^-1或200μg·mL^-1的对照品溶液一定量及内标溶液6μL，制成0.3、0.6、1.5、3、6、12、20μg·mL^-1的系列标准溶液，按步骤(4)处理后，按步骤(3)进样测定峰面积，以伏立康唑的浓度(C)为横坐标，校正因子f(伏立康唑的峰面积/内标峰面积)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程f＝0.1251C+0.0076(R²＝0.9999，n＝7)，按信噪比(S/N)≈10时，伏立康唑最低定量限为0.8ng，当S/N≈3时，最低定量限为0.3ng。

(6)精密度和回收率确定：取(5)中制备的3μg·mL^-1的测定液，连续进样6次，并于当日0、1、2、4、8h及连续测定3天，计算RSD均＜2.0％，取对照溶液，分别加入空白血清各200μL，按照步骤(4)制成血药浓度为0.3、3、12μg·mL^-1的测定液各3份，按步骤(3)进样测定，以实测浓度与实际浓度之比计算提取回收率，结果低、中、高浓度和内标的提取回收率均＞90％，以实测量与加入量之比计算相对回收率，结果均＞95％。

(7)稳定性确定：将质控的血清样品，分别反复冻融3次，并于-20℃保存1月，按步骤(4)和(3)测定，结果RSD均＜3.0％。

(8)耐用性确定：取不同血样，同一检测人员更换不同色谱柱及随机3名工作人员按步骤(4)和(3)测定，结果3份血样的RSD分别＜5.0％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，测定对照品溶液和内标溶液时，理论塔板数按伏立康唑和尼莫地平计算，应不低于4000。