[发明专利]一种N-乙酰神经氨酸的制备方法

权利要求书

1.一种N-乙酰神经氨酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：以大肠杆菌E.coliK-12MG1655为出发菌，敲除其基因组中的nagE基因和manXYZ、nanATEK基因簇，并将cneuB基因和bage基因克隆到pTrcc99a载体，分别加上trc启动子实现2个基因在大肠杆菌中的共表达；

S2：敲除与N-乙酰神经氨酸转运载体相关基因nanT以及与葡萄糖胺转运相关的磷酸转移酶系统相关基因nagE；敲除影响葡萄糖胺6-磷酸合成酶的编码基因glmS表达水平的yhbJ基因来提高转录水平；

S3：克隆S.cerevisiae EBY100的葡萄糖胺酰基转移酶的编码基因GNAT，通过基因敲除的方法整合到大肠杆菌染色体的nagA-nagB基因位点，同时将nagA-nagB基因删除，阻断6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺的分解代谢途径，从而催化6-磷酸葡萄糖胺转化生成6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺；将集胞藻AGE编码基因slr整合到染色体的lacI基因位点，同时将lacI基因删除；

S4：敲除醋酸激酶的编码基因ackA与磷酸乙酰转移酶的编码基因pta阻断乙酸合成的其中一条支路；同时敲除乳酸脱氢酶的编码基因IdhA阻断乳酸生成途径；继续敲除丙酮酸氧化酶的编码基因poxB以阻断乙酸合成的另一条代谢支路；

S5：将上述菌种接种于培养基中，待细胞浓度上升后添加诱导剂，诱导胞内酶的表达；

S6：将菌体收集浓缩后悬浮于添加了底物N-乙酰葡萄糖胺的转化培养基；

S7：用高效液相色谱测定N-乙酰神经氨酸的含量。

2.根据权利要求1所述的N-乙酰神经氨酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S5的培养基中含有胰蛋白胨8-15g/L、酵母2-8g/L、氯化钠8-15g/L和氨苄青霉素0.08-0.12g/L，pH为7.0。

3.根据权利要求2所述的N-乙酰神经氨酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中将培养基接种于摇瓶中，并置于36-38℃摇床中培养2-4h，当细胞浓度达到1.2时，添加诱导剂至浓度为0.2mmol/L。

4.根据权利要求3所述的N-乙酰神经氨酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中将培养基继续振荡培养4h，将菌液收集于冰浴中静置10min，然后于2-5℃的条件下离心15min，除去上清液，用预冷的生理盐水洗涤菌体2次。

5.根据权利要求3所述的N-乙酰神经氨酸的制备方法，其特征在于，所述培养基置于37℃摇床中，旋转速度为200-250r/min，培养3h。

6.根据权利要求3所述的N-乙酰神经氨酸的制备方法，其特征在于，所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷。

7.根据权利要求1所述的N-乙酰神经氨酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中向转化培养基中再次添加诱导剂至浓度为0.2mmol/L，于37℃摇床中，旋转速度为200-250r/min，培养3h。

8.根据权利要求7所述的N-乙酰神经氨酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中转化培养基的成分为甘油10-14g/L、N-乙酰葡萄糖胺75-90g/L、硫酸镁1-3g/L、K₂HPO₄·3H₂O28-34g/L，pH为7.0。