[发明专利]一种N-乙酰神经氨酸的制备方法

说明书

本发明公开了一种N‑乙酰神经氨酸的制备方法，属于化合物制备领域。所述N‑乙酰神经氨酸的制备方法包括以下步骤：以大肠杆菌E.coliK‑12MG1655为出发菌，敲除其基因组中的nagE基因和manXYZ、nanATEK基因簇，并将cneuB基因和bage基因克隆到pTrcc99a载体；将上述菌种接种于培养基中，待细胞浓度上升后添加诱导剂，诱导胞内酶的表达；将菌体收集浓缩后悬浮于添加了底物N‑乙酰葡萄糖胺的转化培养基；用高效液相色谱测定N‑乙酰神经氨酸的含量。本发明在转化培养基中添加的甘油、N‑乙酰葡萄糖胺和异丙基硫代半乳糖苷相互作用，协同提高了N‑乙酰神经氨酸的产量。

技术领域

本发明属于化合物制备领域，具体涉及一种N-乙酰神经氨酸的制备方法。

背景技术

N-乙酰神经氨酸是最普遍存在的唾液酸种类，占据细胞膜中糖蛋白、糖脂或寡糖的末端位置，在生物学、病理学和免疫学过程中起着重要作用，如参与细胞识别、信号转导、肿瘤发生和受精过程。因此，N-乙酰神经氨酸己被用作增强免疫力和促进婴儿大脑发育的营养保健品，同时N-乙酰神经氨酸由于其显着的抗癌、抗粘连和抗炎作用在药物方面有重大应用。因此，随着新应用的推出，N-乙酰神经氨酸的需求将不断增加。

目前N-乙酰神经氨酸的生产方法包括：天然产物提取、化学合成、生物酶催转化、基因工程菌直接发酵及聚唾液酸发酵水解法。绝大多数天然产物中的Neu5Ac含量低，而且组分非常复杂，从中提取Neu5Ac伴随着复杂的过程，回收率低，因此天然产物提取很难满足大规模生产的要求。化学合成法由于繁琐的基团保护、去保护等操作，以及手性异构副产物的存在，该方法亦无法应用于工业生产。生物酶催转化因为转化前体N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸成本高，导致合成成本高。聚唾液酸水解法由于发酵产量低及后处理复杂，成本也居高不下。基因工程菌直接发酵通过对大肠杆菌模式菌株基因改造，使之能够利用普通碳源进行高密度发酵，并达到较高的Neu5Ac产量，近年来该方法受到广泛重视。

中国专利文献″一种提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法及发酵液(专利申请号为CN201811124497.2)″公开了一种提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法，其步骤为：在液体发酵培养基中接种产N-乙酰神经氨酸菌种的种子培养液进行发酵，液体发酵培养基和种子培养液的体积比为25-35∶1，发酵过程维持pH 6.5-7，并在液体发酵培养基中的碳源耗完后，以5-6g/(L·h)的速率补充碳源；每隔36-60h排出85％-95％体积的发酵液，并补入相同体积、不含碳源的新鲜液体培养基。该发明方法工序简单，生产效率高，但是仍然存在有N-乙酰神经氨酸产量有待提高的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种N-乙酰神经氨酸的制备方法，以解决在中国专利文献″一种提高发酵产N-乙酰神经氨酸的方法及发酵液(专利申请号为CN201811124497.2)″公开的基础上，如何优化组分、用量、工艺等，从而提高N-乙酰神经氨酸的产量的问题。

为了解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种N-乙酰神经氨酸的制备方法，包括以下步骤：

S1：以大肠杆菌E.coliK-12MG1655为出发菌，敲除其基因组中的nagE基因和manXYZ、nanATEK基因簇，并将cneuB基因和bage基因克隆到pTrcc99a载体，分别加上trc启动子实现2个基因在大肠杆菌中的共表达；

S2：敲除与N-乙酰神经氨酸转运载体相关基因nanT以及与葡萄糖胺转运相关的磷酸转移酶系统相关基因nagE；敲除影响葡萄糖胺6-磷酸合成酶的编码基因glmS表达水平的yhbJ基因来提高转录水平；