[发明专利]植物细胞转基因纳米载体的制备和应用

说明书

本发明公开了一种植物细胞转基因纳米载体的制备和应用，属于纳米载体技术领域，本发明制备了两种尺寸的介孔硅纳米颗粒，氨基修饰后对其进行表征，并负载含smGFP基因的质粒DNA对拟南芥原生质体进行细胞转导。结果表明：Am‑MSN‑20呈类球形，花形结构的Am‑MSN‑50直径约50nm，两者均带正电荷。Am‑MSN‑50结合DNA的能力高于Am‑MSN‑20，两种纳米载体都表现出了良好的稳定性，能够保护负载的质粒DNA不被细胞核酸酶降解，并且对原生质体没有毒害作用。与Am‑MSN‑20相比较，Am‑MSN‑50具备更高的转导效率。本发明表明，氨基修饰的MSNs有望成为一种安全高效的新型植物基因载体。

技术领域

本发明涉及纳米载体技术领域，特别是涉及一种植物细胞转基因纳米载体的制备和应用。

背景技术

遗传转化是植物分子育种和功能基因组研究的重点工作之一。研发稳定、高效的遗传转化新方法，是遗传育种、分子生物学和基因工程等领域长期关注的焦点问题。目前，基因枪轰击、农杆菌侵染和病毒侵染等是常用的传统植物遗传转化方法。但是，这些方法存在一些不足之处。例如基因枪轰击法具有成本高；容易形成嵌合体，造成转基因的失活或沉默；所需外源DNA量大以及植物组织损伤大等缺点。农杆菌介导转化受体物种有限，并且易产生随机插入造成非目标基因功能失活。对于大多数木本植物或顽拗型基因型的植物来说，仍存在遗传转化技术难题。利用植物病毒介导法对植物基因进行遗传转化效率比较高，但其安全性受到质疑，目前该方法主要用于动物的基因转移。

近年来，随着纳米技术的快速发展，纳米材料作为基因载体在植物遗传转化、动物细胞和医学治疗等领域得到了广泛的应用。纳米材料具备独特的理化性质，表面能大大增加，易与其他原子结合变稳定，粒子上的官能团密度和选择性吸附能力变大，可以通过表面修饰精准地调控其与生物分子(如DNA、RNA以及蛋白)的相互作用。另外，零维和一维的纳米材料可以不借助外力穿透细胞膜，容易进入到植物细胞的内部，使得它成为重要生物分子极佳的传送载体。利用不同化学基团对纳米颗粒表面进行功能化修饰，通过物理或化学亲和作用装载或者吸附靶向外源DNA等核酸分子，构建成纳米核酸复合物。然后，通过静电吸附或化学键作用与细胞受体结合，利用细胞胞吞作用将纳米复合物导入植物细胞，释放外源目的基因，最终实现纳米载体介导的植物遗传转化，是一种具有高效性创新的植物转基因技术。与传统方法相比较，纳米载体不仅能够对蛋白、DNA和RNA等多种生物分子进行有效保护，还可以方便、快捷、高效地把靶标分子导入植物愈伤、胚乳等不同组织，对单子叶植物和双子叶植物都能转导，并且能够进行多基因同时转化。

在众多的转基因纳米材料中，介孔硅纳米粒(mesoporous silicananoparticles，MSNs)因具有颗粒大小均匀、比表面积大、高装载量、易于修饰的内外表面、高稳定性以及良好的生物相容性等特点，正被逐渐用于植物转基因载体材料。2007年，Torney等利用MSNs装载绿色荧光蛋白(GFP)基因，用金纳米粒子进行封堵，利用基因枪将纳米复合物导入烟草叶片细胞，首次实现了MSNs介导基因在植物细胞的转化。此外，Martin-Ortigosa等利用MSNs装载Cre酶蛋白，在借助基因枪外力作用下，将靶基因导入玉米胚中，并且实现了目的基因的表达。MSNs表面进行聚乙烯亚胺修饰后用于装载GUS基因，然后与烟草悬浮细胞混合培养，并且通过超声波处理，目的基因被导入到烟草细胞中并得到了成功表达。不少研究也表明，外源生物分子在无机械无外力辅助下也可通过纳米材料透过细胞壁实现细胞内化。例如，Chang等将mCherry蛋白和GFP蛋白基因装载于MSNs，在不借助外力的情况下，纳米复合物穿透拟南芥根部而进入到植株细胞内。利用激光共聚焦显微镜检查发现，目的基因在根系的表皮层以及更深层次的皮质和内胚层根组织都实现了表达。

然而，MSNs具有较高的表面自由能，大量活性羟基导致其亲水性强，极易发生集聚现象，以至于在有机相中的MSNs分散不均，从而影响材料的结构与性能。另外，MSNs表面带有大量负电荷，不利于装载和吸附同样带负电荷的核酸分子。因此，有必要通过一定的技术手段对MSNs表面进行化学或物理修饰。

发明内容