[发明专利]一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、海大麦幼胚材料的选取和灭菌：选择长度为0.5-1.0 mm的海大麦幼胚，用酒精和次氯酸钠双重表面杀菌，获得无菌外植体；

S2、幼胚的分离与愈伤诱导：准确分离整个幼胚，对幼胚进行横切，抑制实生幼芽，并诱导愈伤组织的发生和增殖；

S3、农杆菌侵染与选择培养：根据愈伤发生和农杆菌生长情况，调整预培养和农杆菌侵染时间，防止菌液过量；

选择培养用的培养基中添加特泯菌和潮霉素；

S4、愈伤的分化、成苗和阳性苗检测：采用弱光遮蔽法进行培养，经不定芽诱导培养和根诱导培养，对获得的组培苗进行DNA提取和PCR检测。

2. 根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法，其特征在于S1、海大麦幼胚材料的选取和灭菌：选择未成熟的种子饱满、胚乳胶状，半透明，长度为0.5-1.0mm的海大麦幼胚，保留麦芒保持幼胚种皮完整，依次用70%酒精灭菌，再用现配次氯酸钠溶液浸泡，随后用灭菌水反复冲洗，获得无菌外植体。

3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法，其特征在于S2、幼胚的分离与愈伤诱导：

取S1中的灭菌种子，置于垫有双层无菌滤纸的培养皿盖上，背部朝上，麦芒末端远离操作者；

利用双镊子尖端夹持法，左手镊子尖端夹持固定种子，右手镊子尖端撕扯麦芒，扯下整个背部种皮，露出整个幼胚；

左手镊子尖端刺穿1/2胚乳处，并始终固定住种子，右手镊子尖端倾斜挤压幼胚上部胚乳，剥离整个幼胚；

将完整幼胚正面朝上，轻柔放于愈伤诱导培养基表面，每皿可放80-100个幼胚，用镊子尖端逐一对幼胚中央进行横切；

22℃黑暗培养7 d，用镊子尖端去除少数实生幼芽，继续黑暗培养7 d，再次去除实生幼芽和质地柔软的非胚性愈伤；更换新的愈伤诱导培养基后黑暗培养2-3周；

如需进行农杆菌侵染以获得转基因植株，则按S3操作；

如直接用于愈伤组织诱导，则取S2中黄色致密的胚性愈伤，22℃黑暗培养3-4周，每两周更换一次不含潮霉素和特泯菌的愈伤诱导培养基，而后转到S4。

4.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法，其特征在于S3、农杆菌侵染与选择培养：

取S2中黄色致密的胚性愈伤，在22℃黑暗环境下预培养1周；

取直径大小为2-3 mm的愈伤块，使用20 μl移液枪吸取农杆菌菌液，逐个滴加在愈伤中央包裹整个愈伤，其后立即吸回多余菌液，略微倾斜培养皿置于超净工作台，待多余菌液吹干后，换至新的愈伤诱导培养基；

共培养36-48 h后，减少愈伤数目至每皿20-30个，更换两轮愈伤诱导筛选培养基，黑暗培养3-4周。

5. 根据权利要求4所述的一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法，其特征在于：农杆菌菌液采用不含抗生素的MG基本培养液，菌液浓度OD₆₀₀ = 0.5-0.6。