[发明专利]一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法，步骤如下：S1、选取长度为0.5‑1.0 mm的海大麦幼胚，用酒精和次氯酸钠双重表面杀菌，获得无菌外植体；S2、准确分离整个幼胚，对幼胚进行横切，以抑制实生幼芽，诱导愈伤组织的发生和增殖；S3、根据愈伤发生和农杆菌生长情况，调整预培养和农杆菌侵染时间，防止菌液过量；S4、采用弱光遮蔽法进行培养，经不定芽诱导培养和根诱导培养，获得转基因幼苗。本发明为海大麦幼胚的组培方法，绿点分化和成苗率高，且不受材料限制；建立的海大麦幼胚转化再生体系，遗传转化率和突变效率高。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法。

背景技术

小麦族是禾本科中最重要的粮食作物来源之一，全球年产量高达9亿吨，占全部谷物产量的30％(FAO，2020)。土壤盐渍化严重制约土地利用与作物生产，是全球农业生产上的一种最主要的非生物胁迫(Munns and Tester,2008,Annu.Rev.Plant Biol.59:651-681)。海大麦(Hordeum marinum)是大、小麦的野生近缘种，是小麦族中耐盐性最强的物种，且与普通小麦有一定的可交配性，因此是小麦耐盐性改良的潜在基因供体(Colmer etal.,2006,J.Exp.Bot.57(5):1059-1078；Islam et al.,2007,J.Exp.Bot.58(5):1219-1229)。解析海大麦特异的耐盐分子机制对优异遗传(基因)资源的利用和小麦耐盐性改良具有重要意义。然而，由于海大麦遗传转化体系尚未建立，目前对其耐盐机理研究和基因功能解析进展仍十分缓慢。

小麦族作物的转基因体系一般采取以幼胚为外植体的农杆菌介导的转化方法，比如六倍体小麦(Hayta et al.,2019Plant Methods.15:121)和大麦(Bartlett et al.,2008,Plant Methods.4:22)。然而在海大麦中还未见有成功的报道，主要原因是一直缺乏合适的再生体系。高效遗传转化体系的建立可为深入开展海大麦优异耐盐基因的功能解析和育种提供有效途径。

发明内容

基于此，有必要针对海大麦遗传转化体系缺失的现状，本发明的主要目的是提供一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法，该方法实现了遗传转化技术在海大麦中的成功应用，并获得了较高的转化率，可应用于海大麦基因功能研究。

本发明的主要目的是通过以下技术方案实现的：

一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法，所述方法包括如下步骤：

S1、海大麦幼胚材料的选取和灭菌：选择长度为0.5-1.0mm的海大麦幼胚，用酒精和次氯酸钠双重表面杀菌，获得无菌外植体；

S2、幼胚的分离与愈伤诱导：准确分离整个幼胚，对幼胚进行横切，抑制实生幼芽，并诱导愈伤组织的发生和增殖；

S3、农杆菌侵染与选择培养：根据愈伤发生和农杆菌生长情况，调整预培养和农杆菌侵染时间，防止菌液过量；

选择培养用的培养基中添加特泯菌和潮霉素；

S4、愈伤的分化、成苗和阳性苗检测：采用弱光遮蔽法进行培养，经不定芽诱导培养和根诱导培养，对获得的组培苗进行DNA提取和PCR检测。

本发明提供一种农杆菌介导的海大麦遗传转化方法和相应的组织培养体系。

作为优选，S1、海大麦幼胚材料的选取和灭菌：选择未成熟的种子饱满、胚乳胶状，半透明，长度为0.5-1.0mm的海大麦幼胚，保留麦芒保持幼胚种皮完整，依次用70％酒精灭菌，再用现配次氯酸钠溶液浸泡，随后用灭菌水反复冲洗，获得无菌外植体。

作为优选，S2、幼胚的分离与愈伤诱导：

取S1中的灭菌种子，置于垫有双层无菌滤纸的培养皿盖上，背部朝上，麦芒末端远离操作者；