[发明专利]一种获得识别空间构象表位抗体的方法

说明书

本发明公开了一种获得识别空间构象表位抗体的方法，其包括如下步骤：构建重组质粒；所述重组质粒表达抗原蛋白和表面锚定蛋白形成的融合蛋白；将重组质粒转入真核细胞，获得重组真核细胞；重组真核细胞表面展示抗原蛋白或抗原蛋白片段；采用重组真核细胞免疫动物，获得杂交瘤细胞；从杂交瘤细胞中分离抗体；该抗体即为识别抗原蛋白空间构象表位的抗体。采用该方法获得的识别CCN1蛋白空间构象表位的抗体—单克隆抗体15G7，其仅结合天然CCN1蛋白，不结合变性CCN1蛋白，即只能专一性的识别天然构象的CCN1蛋白。本发明可以获得识别空间构象表位抗体，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种获得识别空间构象表位抗体的方法。

背景技术

治疗性抗体已被证明是对抗人类疾病的强大工具。迄今为止，市场上大多数治疗性抗体都是通过杂交瘤和噬菌体展示方法开发的。然而，通过这些方法产生的高亲和力抗体依旧充满挑战。由于蛋白抗原本身的特性，采用上述方法获得的抗体可能随机识别并结合到抗原不同结构区域(抗体结合表位)。抗体在体内的生物学活性各异。例如抗CD20抗体依照抗体结合表位分为I型抗体(如美罗华单抗)和II型抗体(如奥比妥珠单抗)，II型抗体引发的补体杀伤作用较I型抗体显著降低但具有更强的抗体依赖的细胞杀伤能力、以及I型抗体所不具有的对靶细胞直接杀伤的能力。在非霍奇金式淋巴瘤的临床数据对比中，与美罗华单抗相比，奥比妥珠单抗显著延长了病人的无进展生存期。又如，抗CD22抗体M971和Epratuzumab由于结合表位的不同，仅后者可以引发CD22分子的迅速内化。综上所述，在抗体筛选过程中，保证所构建抗体筛选文库的多样性是获得具有生物学活性抗体的重要前提。抗原自身的性质决定了从上述方法获得抗体的结合表位的偏好性。抗体结合表位可以是由连续排列的氨基酸所构成的短肽(线性表位)，也可以是由不连续排列的氨基酸所形成的复杂空间构象(空间表位)。抗原上被抗体所结合的线性表位，例如多肽，主要被T淋巴细胞的组织相容性复合体(MHC)所识别，而抗原上不连续的空间构象表位主要被B细胞识别。

产生针对构象表位的抗体是具有挑战性的，因为抗原的空间构象结构必须在动物免疫和体外抗体筛选中得到很好维持。抗原空间构象不稳定性导致候选药物筛选的不一致和不可再现性。一般而言，为了方便蛋白抗原的纯化，需要在抗原表达时预先将纯化标签(如his标签、免疫球蛋白Fc部分)与抗原融合，但这种策略有如下局限性：(1)蛋白质标签的引入可能会破坏抗原的空间结构；(2)这些标签在动物免疫中具有免疫原性，需要引入额外的抗体筛选步骤；(3)为了高效收获抗原并在纯化过程中维持其空间构象，通常需要常规纯化程序进行优化，这样的优化工作是繁琐且费力的。

发明内容

本发明的目的是获得识别抗原蛋白空间构象表位抗体。

本发明首先保护一种获得识别抗原蛋白空间构象表位抗体的方法，可包括如下步骤：

(1)构建重组质粒；所述重组质粒表达抗原蛋白和表面锚定蛋白形成的融合蛋白；

(2)将步骤(1)构建的重组质粒转入真核细胞，筛选，获得重组真核细胞；

所述重组真核细胞表面展示抗原蛋白或抗原蛋白片段；

(3)采用步骤(2)获得的重组真核细胞免疫动物，获得杂交瘤细胞；

(4)从步骤(3)获得的杂交瘤细胞中分离抗体；该抗体即为识别抗原蛋白空间构象表位的抗体。

所述步骤(1)中，表面锚定蛋白可为糖磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)。

所述步骤(1)中，所述抗原蛋白可为CCN1蛋白(蛋白ID为NP_001545.2)。

所述步骤(1)中，所述重组质粒中含有二氢叶酸还原酶抗性基因。