[发明专利]一种筛选调控序列的载体体系和应用

权利要求书

1.质粒载体，其包括：索引标签、报告基因和条码标签；

所述条码标签为长度为5～200bp的随机片段；

所述索引标签的个数至少为1，其独立的选自长度为5～100bp的随机片段；

所述报告基因的表达产物为可通过催化底物反应自身发光或产生颜色变化、可通过催化底物反应使底物发光或产生颜色变化、或经过激发光照射而产生发射光或产生颜色变化、或可抵抗相应药物筛选。

2.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，所述条码标签为长度为40bp的随机片段；所述索引标签的数量为2，其中index1为长度为30bp的随机片段，index2为长度为30bp的随机片段，所述报告基因选自荧光蛋白、荧光素酶、LacZ基因或能起到筛选作用的抗性基因中的至少一种，所述抗性基因包括嘌呤霉素抗性基因。

3.根据权利要求2所述的质粒载体，其特征在于，依次包括如下元件：pUC ori、5’ITR、BGH pA、index1、index2、报告基因、条码标签、WPRE、BGH pA、3’ITR和抗性筛选标记。

4.根据权利要求3所述的质粒载体，其特征在于，所述index1和index2之间还包括酶切位点和随机重组调控序列。

5.根据权利要求4所述的质粒载体，其特征在于，

所述酶切位点为AsiSI；

所述酶切位点的数量为2，位于所述随机重组调控序列的两端；

所述随机重组调控序列为经酶消化后的启动子片段或酶消化后的增强子片段。

6.根据权利要求5所述的质粒载体，其特征在于，所述酶消化的酶为DnaseI；所述启动子选自hRO、hRK、mCAR或ProA1；所述增强子选自CMV_en、HBB_en或SV40_en。

7.根据权利要求1～6任一项所述的质粒载体，其特征在于，

依次包括如下元件：pUC ori、5’ITR、BGH pA、index1、AsiSI酶切位点、index2、Kozak、TurboGFP基因、条码标签、WPRE、BGH pA、3’ITR和Amp抗性筛选标记；其中，条码标签为长度为40bp的随机片段，所述index1为长度为30bp的随机片段，所述index2为长度为30bp的随机片段；

或者依次包括如下元件：pUC ori、5’ITR、BGH pA、index1、AsiSI酶切位点、随机重组调控序列、AsiSI酶切位点、index2、Kozak、TurboGFP基因、条码标签、WPRE、BGH pA、3’ITR和Amp抗性筛选标记；其中，随机重组调控序列的长度为50～2000bp，为经DnaseI酶消化后的启动子片段或酶消化后的增强子片段，条码标签为长度为40bp的随机片段，所述index1为长度为30bp的随机片段，所述index2为长度为30bp的随机片段。

8.权利要求4～7任一项所示质粒载体的构建方法，其特征在于，将条码标签、索引标签和随机重组调控序列插入含有报告基因的骨架载体。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述条码标签的插入为：

制备携带有骨架载体同源臂的条码标签，使其与线性化骨架载体经Gibson克隆反应，构建获得标签文库。

10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述索引标签和随机重组调控序列的插入包括：

制备随机重组调控序列，然后在其两端添加骨架载体的同源臂和索引标签，获得插入片段；

将权利要求9所述构建方法制得的标签文库线性化；

将所述插入片段与线性化的标签文库连接，获得调控序列文库。

11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于，所述随机重组调控序列的制备方法包括，以DnaseI酶对启动子或增强子进行消化。