[发明专利]一种筛选调控序列的载体体系和应用

说明书

本发明公开了一种文库高度多样性的文库构建方法，摒弃了蛋白改组中所采用的体外同源重组技术，通过引入Y型adaptor与DNaseI消化后小于100bp的随机片段连接，成功解决了具有相似特性的或具有特定或未知功能的功能元件无法进行有效重组的缺陷，该方法主要涉及三种文库的构建，分别为构建标签文库、功能元件文库以及索引标签文库，能够快速高通量实现功能元件多样性的构建方法，为最终筛选得到具有优良性能的功能元件奠定了坚实的基础。

本申请是申请日为2020.12.31、发明名称为“一种功能元件的建库方法及其应用”、申请号为202011630533.X的发明的分案申请。

技术领域

本发明属于生物工程领域，更具体地，涉及一种筛选调控序列的载体体系和应用。

背景技术

基因的表达离不开调控序列的作用，启动子或增强子作为调控序列之一，是一段位于结构基因5’上游上下游区域的DNA序列，能够准确地与特定的RNA聚合酶及相关转录因子结合，从而启动下游基因的转录起始，是调控基因表达最重要的顺式作用元件。真核生物启动子包含三种具有重要生物功能的保守序列，分别为位于-35～-25区的TATA盒(TATAbox)、位于-80～-70区的CAAT盒(CAAT box)和位于-110～-80区的GC盒(GC box)。其中TATA盒参与调控下游基因的精确转录起始，CAAT盒和GC盒参与调控转录起始的频率。尽管上述三种功能区域是构成启动子功能活性的重要体现，但并不是每个启动子都包含这三种功能区域，这三个功能区域的任意碱基或相对位置的改变往往会造成启动子活性及特异性的剧烈变化。上游启动子或增强子活性以及基因附近的调控序列如5’UTR和3’UTR是决定下游基因能否顺利表达及表达水平是否适中的关键性因素，因此，为了使目的基因获得更好的表达，在体外利用分子定向进化技术对启动子调控序列进行改造筛选便显得尤为重要。

自然进化是一个漫长的优胜劣汰、有利突变不断积累的过程，为了加快这一进程，研究人员在体外模拟突变、重组和选择的自然进化机制，使进化朝着预期的方向发展。早期研究人员主要采用物理方法、化学方法、致突变菌株或易错PCR等方法将随机突变引入到蛋白质编码基因中，然后进行细胞或动物水平的功能筛选，从而得到能够满足人们需要的新功能或优良性能的蛋白质。这些方法虽然能够在一定程度上改善蛋白的某些特性，但是其所具备的多样性远远无法满足人们的需求。随着分子生物学的不断发展，人们建立了一种基于PCR技术的新的体外定向分子进化技术-DNA改组(DNA shuffling)技术，该技术由Stemmer于1994年首次提出，可用于核酸、蛋白的体外定向进化。DNA改组涉及将不同来源的多个相关基因家族通过DNaseI消化或超声破碎成随机片段，然后利用各片段间的同源性互为模板和引物，经过无引物PCR(primerless PCR)将这些片段重新组装成全长基因，该过程会所产生模板切换或交叉事件，从而增加了突变体文库的多样性。然后利用针对不同蛋白编码框的特异性5’端和3’端引物对蛋白突变体进行扩增，并克隆到相关的克隆载体上形成突变体文库，通过NGS测序验证文库多样性(～106以上)，最后在细胞水平或动物水平进行功能筛选，得到一种具有改良特性的蛋白。该方法主要针对蛋白分子的定向进化，作为起始模板的不同基因之间需要具备一定的同源性，从而产生小片段间的体外同源重组引入突变形成可供筛选的突变体文库。