[发明专利]MSI2-Numb结合代谢分子测定胰腺癌进展的方法

权利要求书

1.MSI2-Numb结合代谢分子测定胰腺癌进展的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(一)肿瘤组织切除阶段检测：

步骤1，肿瘤组织预处理：

将肿瘤组织用DEPC水冲洗，置于冻存管中-80℃冻存待测；取30～50mg肿瘤组织置1.5ml离心管中，加入1.5ml Trizol充分匀浆，室温静置10min；每管加入300μl氯仿，剧烈混匀30sec，静置20min，4℃，10000rpm离心15min；轻轻吸取上层液体400μl至另一新离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，4℃10000rpm离心15min；弃上清，加入2ml 75％酒精洗涤沉淀物，4℃10000rpm离心15min；弃掉上清，室温下晾干10min，每管加入10μl无RNA酶水，在65℃溶解10～15min；

步骤2，测定肿瘤组织Musashi2：

将肿瘤组织进行预处理后，置于PCR反应体系，在PCR反应体系中加入荧光染料Sypro和热启动hTaq酶，所述的荧光染料Sypro能特异性地结合Musashi2而发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步；

所述的PCR反应体系还包括PCR缓冲液、荧光标记Cy5、dATP溶液、dGTP溶液、dCTP溶液、PCR保护剂、钙离子和无菌双蒸水；

所述PCR反应体系还包括8μmol/L正向引物，核苷酸序列为：AGGTTGAGCCATGCAGTCAT；

所述PCR反应体系还包括8μmol/L反向引物，核苷酸序列为：AGGTTGAGCCATGCAGTAGC；

所述PCR反应体系中Musashi2模板量为：以20μL反应体系计，质粒5～10ng，钙离子浓度为3～8mmol/L；

定量PCR反应条件为：90℃4min，95℃15s，50℃35s，40个循环。

步骤3，测定肿瘤组织Numb：

将肿瘤组织进行预处理后，置于PCR反应体系，在PCR反应体系中加入荧光染料Ruby和热启动hTaq酶，所述的荧光染料Ruby能特异性地结合Numb而发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步；

所述的PCR反应体系还包括PCR缓冲液、荧光标记Cy3、dUTP溶液、dGTP溶液、dCTP溶液、PCR保护剂、钙离子和无菌双蒸水；

所述PCR反应体系还包括10μmol/L正向引物，核苷酸序列为：GGCACCCAGCACAATGAAGA；

所述PCR反应体系还包括10μmol/L反向引物，核苷酸序列为：ACTCCTGCTTGCTGATCCAC；

所述PCR反应体系中Numb模板量为：以20μL反应体系计，质粒6～12ng，钙离子浓度为3～8mmol/L；

定量PCR反应条件为：94℃3min，94℃20s，50℃30s，40个循环。

步骤4，测定血液代谢分子：

测定患者血液中分子量为100～3000道尔顿的代谢分子的数量，计算信噪比高于最佳阈值的分子数与所检测代谢分子数的比值：血液与纳米硅进行混合，将混合后的血液在质谱的靶板上制样，用质谱仪获得数据(精度为0.001-0.1道尔顿)，获得的数据为100道尔顿以上的代谢分子的相对数量值M，然后选择100～3000道尔顿，且信噪比大于2.10的所有代谢分子的数量值N；

步骤5，综合判定：

根据肿瘤组织中的Musashi2含量高于正常值的程度，以及肿瘤组织中的Numb含量低于正常值的程度，并结合血浆中所有检出的分子量为100～3000道尔顿，且信噪比大于2.10的代谢分子的数量之间的比例高于正常值的程度，判定肿瘤恶化程度；

(二)预后阶段检测：

步骤1，测定血液Musashi2：

将术后患者的血液预处理后，置于PCR反应体系，在PCR反应体系中加入荧光染料Sypro和热启动hTaq酶，所述的荧光染料Sypro能特异性地结合Musashi2而发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步；

所述的PCR反应体系还包括PCR缓冲液、荧光标记Cy5、dATP溶液、dGTP溶液、dCTP溶液、PCR保护剂、钙离子和无菌双蒸水；

所述PCR反应体系还包括9μmol/L正向引物，核苷酸序列为：AGGTTGAGCCATGCAGTCAT；

所述PCR反应体系还包括9μmol/L反向引物，核苷酸序列为：AGGTTGAGCCATGCAGTAGC；

所述PCR反应体系中Musashi2模板量为：以20μL反应体系计，质粒5～10ng，钙离子浓度为6～8mmol/L；

定量PCR反应条件为：90℃4min，95℃15s，50℃35s，40个循环。

步骤2，测定血液Numb：

将术后患者的血液预处理后，置于PCR反应体系，在PCR反应体系中加入荧光染料Ruby和热启动hTaq酶，所述的荧光染料Ruby能特异性地结合Numb而发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步；

所述的PCR反应体系还包括PCR缓冲液、荧光标记Cy3、dUTP溶液、dGTP溶液、dCTP溶液、PCR保护剂、钙离子和无菌双蒸水；

所述PCR反应体系还包括12μmol/L正向引物，核苷酸序列为：GGCACCCAGCACAATGAAGA；

所述PCR反应体系还包括12μmol/L反向引物，核苷酸序列为：ACTCCTGCTTGCTGATCCAC；

所述PCR反应体系中Numb模板量为：以20μL反应体系计，质粒6～12ng，钙离子浓度为5～10mmol/L；

定量PCR反应条件为：94℃3min，94℃20s，50℃30s，40个循环。

步骤3，测定血液代谢分子：

测定患者血液中分子量为100～3000道尔顿的代谢分子的数量，计算信噪比高于最佳阈值的分子数与所检测代谢分子数的比值：血液与纳米硅进行混合，将混合后的血液在质谱的靶板上制样，用质谱仪获得数据(精度为0.001-0.1道尔顿)，获得的数据为100道尔顿以上的代谢分子的相对数量值M，然后选择100～3000道尔顿，且信噪比大于2.10的所有代谢分子的数量值N；

步骤4，预后判定：

预后阶段进行多次血液检测，每一次检测结果与上一次检测结果进行对比；

测定术后患者的血液中Musashi2含量高于上一次测定的血液中Musashi2含量，且测定术后患者的血液中Numb的含量低于上一次测定的血液中Numb含量，以及且测定术后患者的血液中所有检出的分子量为100～3000道尔顿，且信噪比大于2.10的代谢分子的数量之间的比例高于上一次测定值，则表明该患者的病情有所发展或者进一步恶化；反之则表明该患者的病情好转。