[发明专利]一种基于RT-RPA-LFD技术快速检测苹果茎沟病毒的方法

权利要求书

1.一种基于RT-RPA-LFD技术快速检测苹果茎沟病毒的方法，其特征在于，所述基于RT-RPA-LFD技术快速检测苹果茎沟病毒的方法包括以下步骤：

步骤一，引物设计；

步骤二，材料采集、RNA提取与cDNA合成；

步骤三，RT-RPA法检测苹果ASGV；

步骤四，一步法RT-RPA检测苹果ASGV。

2.如权利要求1所述的基于RT-RPA-LFD技术快速检测苹果茎沟病毒的方法，其特征在于，步骤一中，所述引物设计，包括：在NCBI上下载已报道的序列，设计RPA引物对ASGV外壳蛋白基因进行克隆并测序，所测序列用DNAMAN与NCBI上已报道的相应病毒序列进行比对，明确位于病毒基因组的保守区，在保守区用Primer Premier6或者NCBI中BLAST下的PrimerBLAST设计引物；RPA引物和探针位于ASGV外壳蛋白基因序列的保守区，引物长度等多个方面与普通PCR引物不同，引物由生工(西安擎科)合成。

3.如权利要求2所述的基于RT-RPA-LFD技术快速检测苹果茎沟病毒的方法，其特征在于，所述引物和探针序列，包括：检测ASGV的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，检测ASPV的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，检测ACLSV的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，检测ASSVd的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，检测ADFVd的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，检测ApMV的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，nfo-ASGV的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，nfo-Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

4.如权利要求1所述的基于RT-RPA-LFD技术快速检测苹果茎沟病毒的方法，其特征在于，步骤二中，所述材料采集、RNA提取与cDNA合成，包括：

在苹果基地采集苹果叶片，单一感染苹果茎沟病毒ASGV试管苗以及脱毒苗为苹果超低温脱毒课题组建立的脱毒苹果“嘎啦”系；

使用OMEGA植物RNA快速提取试剂盒，获得去除基因组的总RNA，进行反转录或-80℃冰箱保存备用；反转录产物cDNA置于-20℃保存；使用用于RNA提取的相同叶片样品制备粗提RNA：用1.5mL管盖夹取13mg叶片浸入300μL新鲜制备的碱性PEG缓冲液中；粗提取物在36～37℃孵育5min，产物直接用于检测或置于冰上短暂保存。

5.如权利要求4所述的基于RT-RPA-LFD技术快速检测苹果茎沟病毒的方法，其特征在于，所述反转录体系，包括：

DEPC水2.5μL，RNA 2μL，下游引物Primer-R 0.5μL，70℃水浴5min；

DEPC水1.75μL，dNTPs 10mM 2.5μL，M-MLV 5×Reaction buffer 2.5μL，M-MLV反转录酶0.5μL，RNA酶抑制剂0.25μL，涡旋震荡，充分混匀，42℃孵育60min，95℃保持5min后，终止反应，cDNA-20℃保存。

6.如权利要求4所述的基于RT-RPA-LFD技术快速检测苹果茎沟病毒的方法，其特征在于，所述碱性PEG缓冲液为6％PEG200和20mM NaOH。