[发明专利]一种基于RT-RPA-LFD技术快速检测苹果茎沟病毒的方法

说明书

本发明属于病毒检测技术领域，公开了一种基于RT‑RPA‑LFD技术快速检测苹果茎沟病毒的方法，包括：材料采集、RNA提取与cDNA的反转录合成；引物设计；重组酶聚合酶扩增和侧流层析试纸条检测。本发明将反转录和重组酶聚合酶扩增结合，建立并优化了RT‑RPA反应条件，综合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的分析结果，选择最适反应条件，RPA反应扩增目的条带大小为267bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示RPA反应获得了预期目的产物。本发明利用一种简单、廉价且快速的RNA提取方法，直接从苹果叶片上粗提取RNA检测苹果ASGV，结果显示所检样品的RT‑PCR和一步法RT‑RPA的检测结果一致。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种基于RT-RPA-LFD技术快速检测苹果茎沟病毒(ASGV)的方法。

背景技术

目前，苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus，ASGV)能侵染苹果、梨、柑橘、杏、李、樱桃、猕猴桃、百合等园艺作物，可导致多种病毒病。ASGV侵染苹果树体后一般不表现症状，但能引起慢性衰退病，严重时可使产量减少45％～73％，导致果实品质下降，对苹果生产造成严重影响。

目前已报到的ASGV检测方法主要有指示植物法、酶联免疫吸附测定(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)、RT-PCR以及定量逆转录PCR(RT-qPCR)等；指示植物法在检测过程中步骤简单易操作,但检测速度较慢,而且灵敏度也较低；ELISA法依赖抗体进行检测，检测灵敏性高，由于果树中糖酚含量较高，病毒含量偏低，经常会有假阴性现象；RT-PCR和RT-qPCR是目前常用的病毒检测方法，但需要配备昂贵的PCR仪和荧光定量PCR仪，且相对费时；因此，亟需一种新的苹果ASGV的检测方法，以弥补现有技术的缺陷。

解决以上问题及缺陷的难度为：PCR和qRT-PCR检测过程中需要以cDNA为模板进行扩增，扩增需要借助专业的仪器设备，PCR产物需通过琼脂糖凝胶电泳检测，整个检测过程耗时耗力不便于田间检测。

解决以上问题及缺陷的意义为：RT-RPA检测以RNA为模板进行恒温扩增，扩增30min后产物可通过侧流层析试纸条直接检测，整个检测过程可在1h内完成，无需昂贵的专业仪器，可用于田间样品检测。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于RT-RPA-LFD技术快速检测苹果茎沟病毒(ASGV)的方法，尤其涉及一种基于一步法RT-RPA技术检测苹果茎沟病毒的方法。

本发明是这样实现的，一种基于RT-RPA-LFD技术快速检测苹果茎沟病毒(ASGV)的方法，所述基于RT-RPA-LFD技术快速检测苹果茎沟病毒(ASGV)的方法包括以下步骤：

步骤一，引物设计；

步骤二，材料采集、RNA提取与cDNA合成；

步骤三，RT-RPA法检测苹果ASGV；

步骤四，一步法RT-RPA检测苹果ASGV。

进一步，步骤一中，所述引物设计，包括：在NCBI上下载已报道的序列，设计RPA引物对ASGV外壳蛋白基因进行克隆并测序，所测序列用DNAMAN与NCBI上已报道的相应病毒序列进行比对，明确位于病毒基因组的保守区，在保守区用Primer Premier 6或者NCBI中BLAST下的PrimerBLAST设计引物；RPA引物和探针位于ASGV外壳蛋白基因序列的保守区，引物长度等多个方面与普通PCR引物不同，引物由生工合成。