[发明专利]一种用于检测固执腐霉的LAMP引物组合物及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测固执腐霉的LAMP引物组合物及其检测方法。用于检测固执腐霉的引物组合物是由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、环引物LF和LB组成。LAMP反应程序为：63℃等温条件扩增60min，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到待检样品中存在的固执腐霉，不需要复杂仪器，能较好满足对固执腐霉的现场检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速检测固执腐霉的LAMP引物组合物及其肉眼可观察检测方法。

背景技术

固执腐霉(Pythium recalcitrans)属于茸鞭生物界(Straminipila)，卵菌门(Oomycota)，卵菌纲(Oomycetes)，霜霉目(Peronosporales)，腐霉科(Pythiaceae)，腐霉属(Pythium)，能侵染烟草、大豆和胡萝卜，引起根腐，苗期腐烂等症状，在烟草、大豆和胡萝卜生产中造成较重的经济损失。目前对该病害还没有有效的防治措施，加强检疫、防止病原菌的传播扩散是控制该病的最有效措施。为此应加强疫情监测，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低固执腐霉引起的损失。

目前，针对固执腐霉的检测技术较少。传统的检测方法主要是应用平板分离法和诱饵法，依据固执腐霉的形态学进行鉴定。该方法耗时耗力，需要丰富和专业的病原菌鉴定经验，而且很难依据形态学特征将固执腐霉与相近种区分开，无法满足田间生产上的需求。随着分子生物学的发展，特别PCR技术的普及，越来越多的分子生物学技术被应用到固执腐霉的检测中。但是这些检测技术往往需要在具有专业仪器、试剂和严格环境条件的实验室中进行，仪器和试剂的价格昂贵且操作要求较高，过程复杂，检测时间仍然较长，不能满足快速检测的需求，不适宜在基层环境中使用推广。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近些年开发的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代普通 PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物—白色的焦磷酸镁沉淀产生。在反应体系中加入SYBR Green、羟基萘酚蓝(HNB) 等显色染料，可通过肉眼观察颜色变化来判定。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。目前此技术已广泛应用于真菌、细菌、病毒和卵菌的快速检测，但在固执腐霉的检测国内外均未见报道。

本发明以ITS基因为检测的靶标序列，设计了固执腐霉的特异性的LAMP引物组合物，在此基础上建立了固执腐霉的LAMP快速检测方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中固执腐霉的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测固执腐霉的问题，而提供了一种快速检测固执腐霉的LAMP检测引物组合物及其分子检测方法，此方法检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

用于检测固执腐霉的LAMP引物组合物，由如SEQ ID N0.1所示的正向内引物FIP，如SEQ ID N0.2所示的反向内引物BIP，如SEQ ID NO.3所示的正向外引物F3，如SEQ IDN0.4所示的反向外引物B3，如SEQ ID N0.5所示的正向环引物LF，如SEQ ID N0.6所示的反向环引物LB。

本发明所述的引物组合物在检测固执腐霉中的应用，所述的检测为非疾病诊断为目的的检测。

本发明所述的引物组合物在制备固执腐霉的LAMP检测试剂盒中的应用。

一种检测固执腐霉的LAMP试剂盒，含有本发明所述的引物组合物。