[发明专利]一种养殖场禽流感及禽传染性支气管炎病毒检测方法

权利要求书

1.一种养殖场禽流感及禽传染性支气管炎病毒检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1.数字PCR引物探针设计与合成

提供两对检测病毒的专用引物，分别是禽流感病毒引物探针组和禽传染性支气管炎病毒引物探针组，所述禽流感病毒引物探针组包括AIV-F、AIV-Probe和AIV-R，所述禽传染性支气管炎病毒引物探针组包括IBV-F、IBV-Probe和IBV-R，引物序列如下：

AIV-F:5-TGTACGGACTTGCTGTGGCC-3

AIV-Probe:(FAM)5-AGTGGATACGACTTTGAGAGAGAAGGGT-3(BHQ1)

AIV-R:5-GAGACTGAAGACCTGGCTGTT-3

IBV-F:5-GGTGTAGATCTTGGTGGTCTTT-3

IBV-Probe:(VIC)5-CCCCGAGAGCAATGCCGTAGGTTC-3(BHQ1)

IBV-R:5-GTACCATTGGCACACTCTCTAT-3；

S2.样品的选择与处理

(1)选择临床上有呼吸道症状的家禽，剖检后取肺脏、气管等组织放在2mL离心管中，剪碎，并加入适量的灭菌PBS，放入钢珠，在振动频率为20-30HZ的环境下进行振动，时间2min，然后取出钢珠，接着将病料于－80℃冰箱内反复冻融3次，然后放入在离心机内进行离心，完成上述操作后把样品放在－80℃冰箱保存备用；

(2)病毒RNA的提取(参照ABI AMbion试剂盒操作说明进行病毒核酸提取)；

(3)流感病毒及传染性支气管炎病毒质粒标准品制备；

S3.RT-dPCR流程操作

①.RT-dPCR反应体系的配置

将2×One-Step Solution、One Step Enzyme Mix、引物、探针及提取的样本RNA模板加入灭菌PCR反应管中，添加DEPC水至总体积30μl，同时设置阳性、阴性对照，使用PCR仪进行扩增反应；

②.RT-dPCR微滴生成

a.将新的DG8 cartridge放入holder中，先将30ul样品反应液加入到GD8cartridge第一排(水)的8个孔内。

b.在GD8cartridge第二排(油)的8个孔内分别加入180ul微滴生成油。

c.盖上微滴生成板胶垫，将微滴生成板用胶垫盖好。

d.检查DG8 cartridge放入holder是否盖好，如盖好轻轻平稳放置微滴生成仪中，打开电脑程序开始运行，大约300秒即可生成微滴，形成油包水微滴；

③.RT-PCR扩增

取出8连扳，盖好胶盖，做好标记进行RT-PCR扩增；

④.微滴信号的读取

将扩增完的PCR 8连扳，放入数字微滴分析仪，打开电脑程序，进行微滴数据读取，数字PCR微滴分析仪会自动吸取每个样品中的微滴进行FAM及VIC通道检测，能检测到的蓝色荧光信号为FAM阳性微滴，能检测到的绿色荧光信号为VIC阳性微滴，无蓝色荧光信号的为FAM阴性微滴，无绿色荧光信号的为VIC阴性微滴。软件会自动记录样品的阳性微滴的比例数，并根据泊松分布原理计算出检测浓度拷贝数；

S4.双重RT-dPCR灵敏性实验

分别以AIV与IBV质粒标准品为样本，统一稀释到8.3×10⁵copies/uL，然后进行10^-1、10^-2、10^-3，10^-4，10^-5，10^-6十倍梯度稀释，进行RT-dPCR反应，通过FAM和VIC通道检测扩增情况；

S5.双重RT-dPCR特异性实验

用AIV和IBV质粒标准品为样本，分别以新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒为对照样本，PBS为阴性对照及空白对照，用上述方法进行对比，分别读取结果。

2.根据权利要求1所述的一种养殖场禽流感及禽传染性支气管炎病毒检测方法，其特征在于：所述S3①步骤中的RT-dPCR反应体系由AIV-F、AIV-R、AIV-Probe、IBV-F、IBV-R、IBV-Probe、2×One-Step Solution、One Step Enzyme Mix、RNA和DEPC水组成。