[发明专利]一种养殖场禽流感及禽传染性支气管炎病毒检测方法

说明书

本发明提供一种养殖场禽流感及禽传染性支气管炎病毒检测方法，涉及生物检测领域。该养殖场禽流感及禽传染性支气管炎病毒检测方法，包括S1.数字PCR引物探针设计与合成；S2.样品的选择与处理；S3.RT‑dPCR流程操作；S4.双重RT‑dPCR灵敏性实验和S5.双重RT‑dPCR特异性实验，所述禽流感病毒引物探针组包括AIV‑F、AIV‑Probe和AIV‑R，所述禽传染性支气管炎病毒引物探针组包括IBV‑F、IBV‑Probe和IBV‑R。通过本检测方法对这两种病原进行检测不仅能够提高检测的灵敏度，还能够对病毒含量低的样品进行检测，能够精准地把控疾病控制效果，避免出现大规模的禽流感传染，减少养殖企业的经济损失，该检测方法还可以同时检测两种病原，从而显著地提高了检测效率。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体为一种养殖场禽流感及禽传染性支气管炎病毒检测方法。

背景技术

禽流感病毒宿主范围广泛并可造成人感染，禽传染性支气管炎病毒与当前新冠病毒同属于一个病毒科，这两种病毒在养鸡场感染率均较高，给养殖业造成了较大的经济损失。

当前用于这两种病原的检测方法常为普通荧光检测，灵敏度较低，不能有效检测病毒含量低的样品，不能精准把控疫病控制效果。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种养殖场禽流感及禽传染性支气管炎病毒检测方法，解决了传统病原检测方法灵敏度较低，不能有效检测病毒含量低的样品，不能精准把控疫病控制效果的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种养殖场禽流感及禽传染性支气管炎病毒检测方法，包括以下步骤：

S1.数字PCR引物探针设计与合成

提供两对检测病毒的专用引物，分别是禽流感病毒引物探针组和禽传染性支气管炎病毒引物探针组，所述禽流感病毒引物探针组包括AIV-F、AIV-Probe和AIV-R，所述禽传染性支气管炎病毒引物探针组包括IBV-F、IBV-Probe和IBV-R，引物序列如下：

AIV-F:5-TGTACGGACTTGCTGTGGCC-3

AIV-Probe:(FAM)5-AGTGGATACGACTTTGAGAGAGAAGGGT-3(BHQ1)

AIV-R:5-GAGACTGAAGACCTGGCTGTT-3

IBV-F:5-GGTGTAGATCTTGGTGGTCTTT-3

IBV-Probe:(VIC)5-CCCCGAGAGCAATGCCGTAGGTTC-3(BHQ1)

IBV-R:5-GTACCATTGGCACACTCTCTAT-3；

S2.样品的选择与处理

(1)选择临床上有呼吸道症状的家禽，剖检后取肺脏、气管等组织放在2mL离心管中，剪碎，并加入适量的灭菌PBS，放入钢珠，在振动频率为20-30HZ的环境下进行振动，时间2min，然后取出钢珠，接着将病料于－80℃冰箱内反复冻融3次，然后放入在离心机内进行离心，完成上述操作后把样品放在－80℃冰箱保存备用；

(2)病毒RNA的提取(参照ABI AMbion试剂盒操作说明进行病毒核酸提取)；

(3)流感病毒及传染性支气管炎病毒质粒标准品制备；

S3.RT-dPCR流程操作

①.RT-dPCR反应体系的配置