[发明专利]一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法

说明书

本发明提出了一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法，包括如下步骤：(1)成熟花蕾，取花药，卡诺氏固定液固定后，取花粉；(2)在质量浓度40～50％醋酸溶液中加入洋红，煮沸1.5～2.5h，煮沸期间定时加入水维持溶液体积，煮沸冷却后，加入纳米铁络合物，搅拌，过滤，得醋酸洋红络合染色液；(3)将花粉进行浸染处理，采用醋酸洋红络合染色液染色后镜检。本发明通过改进醋酸洋红染色液的配制方法和花粉检测的处理方法，可有效避免醋酸洋红染色液用于二倍体香蕉花粉活力的染色困难等问题，使染色结果接近离体萌发法检测花粉活力的结果，减少醋酸洋红染色的检测误差，操作简单，适用于野外取材和大量样品的检测。

技术领域

本发明涉及花粉活力检测技术领域，特别涉及一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法。

背景技术

大部分的栽培蕉都起源于两个种：尖叶蕉(Musa.acuminate,AA)和长梗蕉(Musa.balisiana,BB)。由于染色体结构变异等因素导致尖叶蕉在种内形成生殖隔离，从而形成不同亚种。不同的尖叶蕉亚种间杂交产生了具有品种特征的遗传和结构杂合性，杂交种融合了不育基因和单性结实基因，从而产生出食用二倍体栽培香蕉(AA)。通过现有的文献报道来看，不少香蕉野生种和栽培种都有一定的结实率，花粉还有一定的育性。目前已经有一些香蕉杂交育种方面的报道，而花粉活力鉴定和花粉保存方法是保证成功杂交的重要因素，但目前关于香蕉花粉活力鉴定还比较少。检测花粉活力的方法通常有染色法和离体萌发法，染色法检测虽然迅速便捷，但不同的染色方法结果有较大的偏差，因此有必要对香蕉花粉活力检测比较准确的方法进行筛选。离体萌发法检测花粉活力比较准确，但操作比较繁琐且成本高。

早期的香蕉细胞遗传学研究发现，醋酸洋红的染色方法并不适用于香蕉，而本发明采用特定的改进方法，可有效避免醋酸洋红染色困难等问题，使染色结果接近离体萌发法检测花粉活力的结果；相比碘化钾和亚历山大染色法，醋酸洋红染色法在成本和使用难易程度上更具有优势，非常适合于野外取材，并减小检测的误差。但目前系统研究香蕉花粉离体萌发的研究资料很少，本研究将对香蕉花粉离体萌发的条件进行细致的探索，并以此为依据，对改进的香蕉花粉染色法进行验证，达到筛选适用于香蕉花粉活力检测的方法。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提出一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法，减少传统采用醋酸洋红染色法检测二倍体香蕉花粉活力的偏差值，并提高染色结果的准确度，使改进后的醋酸洋红染色液染色结果接近离体萌发法检测花粉活力的结果。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种二倍体香蕉花粉活力的检测方法，包括以下步骤：

(1)收集花粉：采集成熟花蕾，取花药，经卡诺氏固定液固定8～16h，取花粉；

(2)制备醋酸洋红络合染色液：按用量比为(90～110)mL：(0.5～1.5)g，在质量浓度40～50％醋酸溶液中加入洋红，搅拌，得混合溶液，将混合溶液煮沸1.5～2.5h，煮沸期间定时加水维持混合溶液体积，煮沸冷却后，以混合溶液计，按体积比为1：0.2～0.4，加入纳米铁络合物，以500～600r/min速率搅拌20～30min，过滤，得醋酸洋红络合染色液；纳米铁形成的铁盐络合物，带有的电荷基团和极性分子，充分搅拌可使其络合效应更好地提高染色液助色基团的极性，但络合物过量则影响反应粒子和溶剂分子的反应速率和反应活性，易使溶液生成沉淀而破坏络合物的稳定性；

(3)检测花粉活力：取步骤(1)所得花粉，浸染处理后，置于载玻片上，滴加1～3滴醋酸洋红络合染色液，染色5-10min后镜检；

进一步说明，卡诺氏固定液为由体积比为3：1～2的无水乙醇溶液和冰醋酸配制而成。