[发明专利]一种基于复合水凝胶的干细胞与胰岛β细胞共培养方法

说明书

本发明公开了一种基于复合水凝胶的干细胞与胰岛β细胞共培养方法。属于干细胞及组织工程技术领域，步骤：以小鼠胰岛β细胞系MIN6细胞为模型，培养得MIN6细胞；将复合水凝胶材料用PBS清洗浸泡；将MSC细胞与MIN6细胞以直接接触的共培养方式均匀分布在浸泡过的复合水凝胶材料的表面；将复合水凝胶材料放置于培养箱过夜，待细胞贴壁后添加培养基；设置二维平面细胞培养，将两种培养模式的细胞置于培养箱内培养，利用倒置显微镜观察MSC细胞与MIN6细胞共培养后自发形成的多细胞球形貌。在本发明中，将复合水凝胶材料(3D水凝胶)的脐带间充质干细胞和胰岛β细胞共培养，有利于体外构建的胰岛β细胞球微组织活性和分泌功能。

技术领域

本发明属于干细胞及组织工程技术领域，涉及一种基于复合水凝胶的干细胞与胰岛β细胞共培养方法，具体是涉及一种基于复合水凝胶材料细胞培养体系的脐带血间充质干细胞与胰岛β细胞共培养的方法。

背景技术

糖尿病是严重危害人类健康的慢性疾病之一。与传统治疗方法相比，胰岛移植技术可以更好地模拟生理性的胰岛素分泌，并且为患者提供了一种风险较小且疗效更好的替代疗法。然而，胰岛供体来源短缺、移植后的免疫排斥反应、胰岛的提取及移植过程中胰岛数量及质量的损失等问题严重限制了胰岛移植在临床上的广泛应用。而在胰岛中，胰岛β细胞是已知的产生胰岛素的唯一内分泌细胞，胰岛β细胞功能障碍甚至被认为是糖尿病发生的根本原因。因此，近年来通过体外培养胰岛β细胞构建功能性类胰岛组织之后进行移植成为新的热点。虽然体外培养技术在不断改进，但是培养时细胞的存活率下降和移植后细胞的活力及功能损失，从而导致移植细胞的效能下降，仍然是胰岛素分泌细胞移植治疗糖尿病的一大阻碍。究其原因，是由于胰岛细胞在生长过程中具有功能性成团的特点，最适宜其生长的细胞微环境是三维的。而目前最普遍的二维平面细胞培养方法未能给胰岛细胞的生长及成团提供完备且适宜的三维细胞微环境。

通过组织工程策略，就是利用生物材料与胰岛共移植，包括筛选理想的细胞外基质替代物即支架材料，并进行活性修饰(例如药物、活性分子的固定等)，构建适宜胰岛生长的细胞外微环境，同时降低炎症反应和免疫排斥反应，改善胰岛的存活和功能。研究表明，胰岛细胞具有力学敏感性，采用必要的细胞外基质，可以引导类似胰岛结构的形成；也可以通过细胞外基质与细胞表面的黏附分子作用、转导细胞信号、促进细胞存活和β细胞分化。例如，使用藻酸盐胶囊包裹胰岛细胞，进行体外培养，发现胰岛体外培养细胞的存活率增加而且移植后疗效更佳。然而，目前支架材料仍然存在力学强度较差易坍塌、可调节的物理性能单一、难以保证胰岛生存所需要的营养物质和氧气运输等关键问题，无法为维持胰岛细胞的存活和功能提供最佳的三维细胞微环境以及有效解决胰岛移植存在的免疫排斥问题。因此，筛选理想的细胞外基质替代物，也就是三维支架材料非常重要。

胰岛长期维持形态和发挥功能依赖于胰岛组织的重构，这需要通过体外微环境构建促进细胞迁移、增殖、分泌和血管新生等，寻找一种方法可促进胰岛细胞更成熟，纯度更高的方法是亟待解决的问题。有研究表明，生理条件下，细胞与细胞，组织与组织之间是紧密联系的，细胞分泌因子可促进临近细胞的功能，间充质干细胞分泌的VEGF等多种因子、细胞间基质可以促进胰岛活性与功能，因此，本发明研发一种基于3D水凝胶模拟最优的三维胰岛细胞微环境，将干细胞与胰岛β细胞共培养，在体外构建具有更好功能性的胰岛β细胞球微组织。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供了一种基于新型复合水凝胶材料建立的三维培养体系，在本体系中，将胰岛β细胞和干细胞共培养，从而更有利于体外构建的胰岛β细胞球微组织活性和分泌功能。

技术方案：本发明所述的一种基于复合水凝胶的干细胞与胰岛β细胞共培养方法；具体操作步骤如下：

(1)、以小鼠胰岛β细胞系MIN6细胞为模型，用含20％(v/v)牛血清(Gibco，南美)、1M HEPES及50μβ-巯基乙醇的DMEM高糖培养基(Sigma)进行培养，得MIN6细胞；待到70-80％融合后以1：2的方式进行传代；