[发明专利]一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备及应用

权利要求书

1.一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：

(1)以FAdV-4毒株DNA为模板，fiber2-F和fiber2-R为引物，PCR扩增出fiber2序列；

fiber2-F：5’-ATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGACATTC-3’；

fiber2-R：5’-GCTGTCCAGCGGCCTCCCTCCCGTAA-3’；

所述fiber2序列为SEQ ID NO：3；

(2)将步骤(1)扩增出的fiber2序列N段插入BamHⅠ酶切位点，在C端终止密码子之前插入6×His标签以及HindⅢ酶切位点，然后进行密码子优化并合成序列，得到经过密码子优化的fiber2序列；所述经过密码子优化的fiber2序列为SEQ ID NO：4；

(3)将步骤(2)经过密码子优化的fiber2序列构建到pMal-c2X载体上，得到重组质粒pMal-c2X-FAV4-fiber2；

(4)将步骤(3)所得重组质粒pMal-c2X-FAV4-fiber2转化大肠杆菌BL21进行诱导表达，得到I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCR扩增体系如下：

PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸54s，共34个循环；72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述将经过密码子优化的fiber2序列构建到pMal-c2X载体上的步骤为：

将经过密码子优化的fiber2片段与空载体pMal-c2X用BamHⅠ和HindⅢ两种限制性核酸内切酶进行双酶切，酶切结束后，进行1％核酸凝胶电泳纯化，将目的条带切胶后进行胶回收，得到回收的目的片段fiber2和回收的空载体，然后将回收的目的片段fiber2和回收的空载体在T4连接酶条件下进行连接反应，得到重组质粒pMal-c2X-FAV4-fiber2。

4.根据权利要求3所述的一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备方法，其特征在于，所述双酶切的反应时间为4h，反应温度为37℃，反应体系如下：

所述连接反应的反应时间为12h，反应温度为16℃，反应体系如下：

5.根据权利要求1所述的一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述转化大肠杆菌BL21的步骤为：

1)取重组质粒pMal-c2X-FAV4-fiber2加入E.coli BL21感受态细胞中，冰浴30min；

2)42℃热激90s；冰浴2min；

3)在超净台内加入900μL SOC培养基，置于37℃摇床中220rpm摇1h；

4)取菌液涂布在氨苄抗性LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆加入氨苄抗性LB培养基中摇至OD值为0.8后，菌液和50％甘油1:1混合均匀得到甘油菌悬液，后于-80℃保存备用。