[发明专利]一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备及应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种I群4型禽腺病毒Fiber‑2蛋白的制备及应用。所述制备方法包括：以FAdV‑4毒株DNA为模板，设计引物扩增出fiber2序列，测序正确后，将fiber2序列进行密码子优化，然后将其构建到pMal‑c2X载体上，得到重组质粒pMal‑c2X‑FAV4‑fiber2；最后转化大肠杆菌BL21进行诱导表达，得到I群4型禽腺病毒Fiber‑2蛋白。本发明方法只需要在37℃诱导3h即可，时间短，操作简单，其表达的目的蛋白是有利于纯化的可溶性蛋白，只需要一步镍柱层析，便可获得大量目的蛋白，而且成本低，易放大。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备及应用。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)属于禽腺病毒科禽腺病毒属成员，是呈二十面体对称的无囊膜线性双股DNA病毒，其基因组线性长度约43～45kb，病毒直径为70～100nm。腺病毒的核衣壳有3个主要结构蛋白：六邻体蛋白(Hexon)、纤突蛋白(Fiber)和五邻体蛋白(Penton)。禽腺病毒分为I、Ⅱ、Ⅲ三个亚群，I亚群包括鸡、火鸡、鸭和鹅常规腺病毒，Ⅱ亚群和Ⅲ亚群禽腺病毒分别以火鸡出血性肠炎病毒和产蛋下降综合征病毒为代表。根据限制性内切酶片段图谱和核酸序列等分子生物学标准又将I群禽腺病毒分为A-E五个种，每个种内的病毒根据血清交叉中和试验结果进一步分为12个血清型(1～7、8a、8b、9～11)。

不同血清型对禽类的致病作用存在差异，FAdV-1与肌胃糜烂(Gizzarderosion，GE)有关，FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11，感染鸡能引起包涵体肝炎(Inclusionbodyhepatitis，IBH)，而FAdV-4是肝炎-心包积液(hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)的主要病原体。研究表明，FAdV可在健康禽体内复制，症状非常轻微或不表现感染症状，但与免疫抑制病(鸡传染性贫血、鸡传染性法氏囊病)混合感染时可成为条件性病原，从而影响禽类宿主的健康。

已经证明HHS是由FAdV-4单独引起的。由FAdV-4引起的HHS是一种异常侵袭性的临床疾病，病程发展迅速，高死亡率是其主要临床表现。感染FAdV-4的鸡群可出现不同程度的临床症状，包括昏睡，食欲不振，羽毛杂乱，排黄绿色稀粪，体重减少导致饲料转换率下降，但有的没有特征性症状，突然发病死亡，剖检可见肝脏变黄、出血肿胀、偶有坏死灶，最明显的病变为心包腔中有淡黄色清亮的积液，还可观察到肾脏肿大、出血苍白等病变。由FAdV-4引起的HHS给家禽养殖业尤其肉禽的养殖造成很大的经济损失，此时的科研工作主要集中在调查流行株的血清型，疫病的防控特别是疫苗的研发等方面。

在FAdV-4疫苗防控方面，许多研究人员使用甲醛灭活病禽的肝组织匀浆制备的甲醛灭活疫苗可成功预防该病。但此类疫苗也存在一些缺陷，比如禽肝组织匀浆液可能引发其他细菌和病毒的感染，灭活不完全也可导致HHS和其他病原体的进一步传播。有研究发现自巴基斯坦首次爆发HHS以来，之后的大多数疫情其实发生在接种疫苗后，说明该疫苗的安全性以及有效性还需进一步研究，因此建议使用鸡胚或者细胞培养病毒代替不健康的肝脏匀浆。而鸡胚繁殖病毒含量低，原代肝细胞肾细胞制备繁琐、易污染、不易转染，且在制备细胞过程中易混入鸡胚成纤维细胞(CEF)，不利于实验操作，且灭活苗存在灭活不彻底的隐患。所以亟需研究新的、安全性更好的抗原及其制备的疫苗。

亚单位疫苗一直是疫苗研究的热点，其优势在于能够避免灭活苗和弱毒疫苗毒力返强等问题。FAdV-4的两条Fiber蛋白(Fiber 1和Fiber 2)，分别由两条不同的Fiber基因编码，且两条Fiber蛋白的长度差异显著，重组Fiber 2蛋白比Fiber 1蛋白活性更好，对FAdV-4的保护作用更强。鉴于此，Fiber 2蛋白被认为是FAdV-4的一种重要的保护性抗原蛋白，在新型重组蛋白亚单位疫苗研究方面具有潜在的开发应用价值。