[发明专利]一种还原核酸的方法及其检测方法有效
| 申请号： | 202111265079.7 | 申请日： | 2021-10-28 |
| 公开（公告）号： | CN113943763B | 公开（公告）日： | 2022-10-04 |
| 发明（设计）人： | 沈璐;刘佳慧;姜叶;钟文星;赵美茹;易鑫 | 申请（专利权）人： | 深圳吉因加医学检验实验室;苏州吉因加医学检验有限公司 |
| 主分类号： | C12P19/34 | 分类号： | C12P19/34;C12N15/10;C12Q1/6844;C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 深圳鼎合诚知识产权代理有限公司 44281 | 代理人： | 周建军;彭家恩 |
| 地址： | 518000 广东省深圳市*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 还原 核酸 方法 及其 检测 | ||
1.一种还原核酸的方法，其特征在于，包括依次对核酸进行末端修复、加“A”、接头连接、氧化，对氧化后的核酸不进行纯化，直接进行还原；所述氧化包括TET酶氧化，还原体系含有有机硼烷；所述有机硼烷包含硼烷与选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物，所述氮杂环包含吡啶、2-甲基吡啶，所述叔胺选自三(叔丁基)胺。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化包括将核酸中的5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶中的至少一种转化为5-羧甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶中的至少一种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化后的核酸含有5-羧甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶中的至少一种。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原包括将氧化后的核酸中的5-羧甲基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶中的至少一种转化为二氢尿嘧啶。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，氧化体系中TET酶的终浓度为2~10μM；
或，每50μL氧化体系中加有4~8μL TET酶。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，氧化体系中还含有氧化缓冲液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述氧化缓冲液含有如下组分中的至少一种：缓冲剂、金属盐、α-酮戊二酸盐、抗坏血酸腺苷三磷酸、二硫苏糖醇。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述氧化缓冲液含有如下浓度的组分中的至少一种：167±20mM缓冲剂、333±20mM金属盐、3.3±0.2mM α-酮戊二酸盐、6.67±1 mM抗坏血酸、4±0.5 mM三磷酸腺苷、8.33±1mM二硫苏糖醇；
或，所述缓冲剂包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷中的至少一种；
或，所述金属盐包括氯化钠；
或，氧化体系中还含有Fe2+；
或，含有Fe2+的化合物包括Fe(NH4)2(SO4)2、Fe2SO4中的至少一种；
或，氧化体系中Fe2+的终浓度为50~100μM；
或，氧化体系的pH＜8；
或，每50μL氧化体系中加有7~15μL所述氧化缓冲液。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，氧化体系的pH为4.0~7.5。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，氧化体系的pH为4.3~7.5。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氮杂环包含2-甲基吡啶，并且所述有机硼烷是2-甲基吡啶硼烷；
或，所述有机硼烷包含硼烷和叔胺的络合物；
或，所述有机硼烷包含吡啶硼烷。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原体系还含有有机酸盐。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述有机酸盐包括醋酸钠。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原体系的pH为4.0~4.5。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原体系的pH为4.3。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对还原后的核酸进行纯化。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述纯化包括磁珠纯化、离心柱纯化中的至少一种。
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