[发明专利]一种还原核酸的方法及其检测方法

说明书

一种还原核酸的方法及其检测方法，还原核酸的方法，包括对氧化后的核酸不进行纯化，直接进行还原。对氧化后的核酸直接还原，无需在氧化后、还原前进行纯化，实现同管还原，显著提升转化回收率，而且使得回收率更稳定。减少了氧化与还原步骤之间的纯化步骤，简化了实验操作步骤，缩短了时间，降低了检测成本，同时不影响后续文库扩增效率和转化率。

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种还原核酸的方法及其检测方法。

背景技术

早在1925年，在DNA双螺旋结构鉴定之前，DNA甲基化修饰就已经被发现。DNA甲基化修饰最主要的形式是5mC及其衍生修饰，被认为是DNA的“第五种碱基”。DNA甲基化在基因调控、遗传印迹、衰老、炎症、肿瘤等生理病理过程中发挥着重要作用。最近研究表明，cell-free DNA(以下简称cfDNA)甲基化特征是肿瘤早期筛查的重要标志物。

重亚硫酸盐可将胞嘧啶(C)脱氨基转化为尿嘧啶(U)，在随后的PCR过程中，采用U耐受的聚合酶，将U识别为胸腺嘧啶(T)，实现C到T的转化，从而达到将未修饰C和甲基化修饰C分开的目的。全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing，WGBS)将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶(约95％的C会被转化为T)，可覆盖全基因组70～99％的胞嘧啶，实现全基因组水平单碱基分辨率甲基化检测。全基因组重亚硫酸盐测序也是甲基化检测的一个“金标准”。但是重亚硫酸盐处理会使DNA大量降解，需要较高的DNA投入量，对于DNA含量较少的样本不友善，例如血浆游离DNA。另外重亚硫酸盐是将未甲基化的胞嘧啶转化成T，而未甲基化的胞嘧啶占基因组所有胞嘧啶的95％以上，因此使用重亚硫酸盐处理后构建的二代测序文库，碱基平衡性差(AT占比80％)，测序时需要添加15％的phix DNA平衡，造成测序数据大量浪费。最后WGBS产生的数据测序质量差，而且比对到基因组时需要使用特殊的软件(例如Bismark)，比对率较差，通常只有70％左右，进一步造成数据的浪费。

公开号为CN 110820050 A的中国专利《全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序文库及构建》记载，在一定条件下，甲基化C可以被10-11转位酶(TET酶)转为羧基化C，通过有机硼烷(例如吡啶硼烷)可以将羧基化的C转化成二氢尿嘧啶，经过测序，可以识别为T，进而区分甲基化C与未甲基化C。鉴于此原理发明的全基因组甲基化非重亚硫酸盐文库构建技术，有效解决了文库复杂度低和测序数据深度低的缺陷，同时可实现在多种二代测序平台的甲基化检测。

使用此非重亚硫酸盐方法构建的文库，不仅能在全基因组水平检测甲基化，而且能同时检测碱基突变，具有检测基因组多种特征的能力，因此具有重要的临床引用价值。近来研究发现，血浆cfDNA甲基化、突变和片段特征在肿瘤早期筛查方面具有重要的价值。但血浆cfDNA是不同组织释放的，而且绝大多数cfDNA来源于正常血细胞，对于早期癌症患者来说，肿瘤组织释放的循环肿瘤DNA(circulating DNA，ctDNA)在血浆中占比极低，因此在构建cfDNA二代测序文库过程中，需要最大限度减少DNA模板损失，提升ctDNA各特征检测的灵敏度。

现有技术中，TET酶氧化步骤结束后，需要用1.8x的磁珠纯化氧化后产物，但是氧化后回收率中位只有约70％，且非常不稳定，范围宽至30％～90％，波动很大。

发明内容

根据第一方面，在一实施例中，提供一种还原核酸的方法，包括对氧化后的核酸不进行纯化，直接进行还原。

根据第二方面，在一实施例中，提供一种检测核酸中5-甲基胞嘧啶残基的存在和/或位置的方法，所述方法包括：

使用第一方面所述方法，获得含有二氢尿嘧啶残基的核酸，然后对所述含有二氢尿嘧啶残基的核酸进行扩增和测序或检测。