[发明专利]一种基于可视化LAMP技术检测桔小实蝇的方法及应用

说明书

本发明提供一种基于可视化LAMP技术检测桔小实蝇的方法，包括：1)以桔小实蝇线粒体COI基因中的含有多态性变异位点的区段为靶基因，设计特异性LAMP引物组；2)利用所述特异性LAMP引物组，以待测样本的全基因组DNA为底物，进行LAMP反应；3)所述LAMP反应结束后，根据检测用核酸染料的显色结果判断待测样本是否为桔小实蝇。本发明还提供了相应的引物组及应用。本发明提供的方法和引物组能够在73个果实蝇属的物种中精确检测桔小实蝇，且具有高灵敏性，可用于生物检疫中对检材的可视化快速检验。

技术领域

本发明涉及生物检疫技术领域，具体涉及一种基于可视化LAMP 技术检测桔小实蝇的方法及应用。

背景技术

实蝇科(Tephritidae)中许多种类具有重要经济影响，不但给发生 地区的水果和蔬菜生产造成重大损失，而且还严重影响着我国水果和 蔬菜的对外出口贸易。桔小实蝇属双翅目(Diptera)实蝇科 (Tephritidae)，广泛分布在亚洲南部、东南部和南太平洋的热带温带 地区。根据已有报道，桔小实蝇对46科的250多种植物的果实产生 危害，尚未见于报道的实际产生危害的果蔬种类更多。由于其危害巨 大，并且容易随寄主果实的调运从而远距离传播，从而严重影响了果 蔬生产和国际贸易，我国和许多国家及地区将其列为重要的进境植物 的检疫性有害生物。

长期以来，实蝇的鉴定主要是基于其形态特征而确定的，由于生 活环境不同，实蝇形态特征会随之发生相应的变化，给鉴定带来困难。 而且，在瓜果蔬菜的检疫过程中，检测到的通常是果蔬携带的实蝇幼 虫，通过传统形态学法很难对实蝇幼虫进行准确鉴定，这给实蝇的检 疫防控带来困难。

目前，虽然有一些现有技术提供了针对个别实蝇种别的鉴定方法， 例如，申请号为201410178620.4的中国专利申请公开了一种将针对 多种生物的引物组混合使用的环介导等温扩增检测方法，但该专利技 术仅针对辣椒实蝇、瓜实蝇、番石榴实蝇和桃实蝇设计混合引物用于 鉴别上述5种实蝇，没有涉及桔小实蝇的特异引物，不能用于检测桔 小实蝇。当前，对于桔小实蝇分子检测的方法主要是基于聚合酶链式 反应(PCR)的技术或实时荧光定量(Real-time PCR)进行的，均存 在试验周期较长、操作繁琐、受检测材料限制、对实验仪器及检测人 员的技术要求高等缺点，因此难以满足基层实验室的检测需求。

等温扩增技术即环介导等温扩增法(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)，是2000年Notomi等开发的一种新的核酸等 温扩增方法。LAMP具有操作简单、快速、灵敏度高等优点，已广 泛应用于病毒、细菌、线虫等鉴定领域。LAMP技术具有如下特点； 1)灵敏度和特异性高：检出限仅为几个拷贝，与pcr相比高出几个数 量级。利用外引物和内引物与目的片段6个特异性部位准确结合发生 扩增反应，只有当引物与目的片段6个区域都匹配时才进行扩增；2) 检测速度快、扩增效率高：LAMP是恒温扩增反应，比PCR用时短， 60分钟内完成基本反应并检测扩增产物。加入环引物后，可缩短反 应时间至30分钟。通过链取代并形成不同环结构而大量扩增，促使 目的基因在反应时间内连续进行指数扩增，扩增数量高于PCR上千 倍；3)设备简单、操作简便：只需要如水浴锅、金属浴等恒温器即 可完成此实验，不需要购置昂贵的PCR仪，易于推广应用；4)产物 易检测：根据LAMP反应特性，判断产物结果的方法有琼脂糖凝胶 电泳检测法、浊度检测法和荧光比色检测法等。LAMP反应过程中产 生多种片段的扩增产物，其在电泳中会形成特异性的梯状条带，此为 电泳检测法。由于LAMP反应过程中产生大量的焦磷酸镁沉淀，通 过实时浊度计检测反应过程中焦磷酸镁沉淀产生的浊度实现定量检 测。通过SYBR green I、钙黄绿素(Calcein)荧光染料的颜色变化来 定性判断靶序列扩增与否，阳性为绿色，阴性为橙色，此为荧光比色 检测法。虽然，在申请号为201711141240.3的中国专利申请中公开 了一种快速可视化瓜实蝇分子检测方法，但是该专利是通过LAMP 技术来鉴定瓜实蝇，也不能用于桔小实蝇检测。因此，如何对桔小实 蝇进行精准、快速检测的问题仍然亟需解决。

发明内容