[发明专利]一种白细胞介素15及其受体-单克隆抗体融合蛋白的纯化贮存方法

说明书

本发明公开了一种白细胞介素15及其受体‑单克隆抗体融合蛋白的纯化贮存方法，用洗脱液洗脱白细胞介素15及其受体‑单克隆抗体融合蛋白，将纯化后的融合蛋白换液保存于贮存液中，并具体公开了洗脱液以及贮存液的成分。本发明针对白细胞介素15及其受体‑单克隆抗体融合蛋白IL15‑IL15Rα‑aEGFR的洗脱液和贮存液进行了优化，找到了一类稳定的缓冲液组成成分，显著提高了蛋白回收率和纯度。

技术领域

本发明涉及抗体分离纯化领域，尤其涉及一种白细胞介素15及其受体-单克隆抗体融合蛋白的纯化贮存方法。

背景技术

白细胞介素-15(IL-15)是一种具有多种生物学活性的细胞因子，可由活化的单核-巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生。IL-15首先被发现是由于它有类似于IL-2的功能，能刺激CTLL细胞活化增殖。IL-15能刺激T细胞产生各种活化抗原，如CD24、CD122、CD95、CD30和CD69等。但后来IL-15在其他免疫细胞发育过程中的作用也逐渐被发现，如NK细胞、NK-T细胞和肠上皮内淋巴细胞等。多项研究表明，IL-15在减轻机体炎症、抗氧化应激、调节脂质代谢及改善胰岛素抵抗方面发挥重要作用，它还可明显减轻血管内皮细胞炎症反应，抑制动脉粥样硬化斑块形成，稳定斑块，改善心肌细胞能量代谢，减少心肌细胞损伤、凋亡，抑制心肌重构。

IL-15属于4α螺旋细胞因子家族，IL-15的受体包含三个亚单位：IL-2Rβ，γC和IL-15Rα。IL-15与IL-15Rα有很高的亲和力，与传统意义上的细胞因子通过直接结合其受体而激活下游信号通路有所不同，目前普遍认为IL-15主要通过一种转提呈的方式发挥作用。IL-15首先结合IL-15Rα阳性的细胞，然后由此IL-15Rα阳性细胞将IL-15进一步提呈给表达IL-2Rβ和γC的其他细胞。

EGFR是ErbB受体家族中的一种跨膜糖蛋白，当它与EGF和转化生长因子-α(TGF-α)结合后，随即EGFR本身发生同型二聚体化反应，开始刺激细胞内激酶并引发下游信号传导的级联反应，从而影响细胞增殖、细胞凋亡和细胞周围的血管新生。表皮生长因子受体(EGFR)和EGFR在细胞表面的结合，阻断了内源性配体与生长因子受体的结合机会，从而抑制受体蛋白酪氨酸激酶的磷酸化，最终抑制下游的信号传导的级联过程。EGFR在某些恶性肿瘤细胞处于高表达状态，例如乳腺癌、肺癌、直肠癌等，EGFR目前已成为肿瘤靶向治疗的一个主要靶点。

抗体融合蛋白是指在基因水平上将目的基因同免疫球蛋白部分片段基因相连，下载并在真核或原核表达系统中表达的重组蛋白。抗体融合蛋白具有抗体的特性及融合功能蛋白的活性，可广泛应用于免疫诊断、免疫治疗、抗体纯化及抗体和抗原的定量分析等，特别可用于免疫导向药物的制备。研究抗体融合蛋白，对于癌症的免疫治疗有着重大的意义。

Protein A是一种从金黄色葡萄球菌中分离出来的细菌细胞壁蛋白，主要通过Fc区域与哺乳动物的IgG结合。Protein A有五个IgG结合结构域。在抗体相关蛋白的纯化过程中，首选Protein A resin作为抗体捕获的亲和层析介质。通常情况下，抗体或者含有Fc区域的融合蛋白在中性条件下与Protein A结合，在酸性条件下进行蛋白洗脱。绝大多是单克隆抗体采用pH2.5-pH3.0的0.1mol/L甘氨酸洗脱溶液，在该条件下，单克隆抗体具有较高的纯度和回收率。但是对于一些性质不稳定的抗体融合蛋白，使用上述溶液进行蛋白洗脱后，蛋白容易产生沉淀，从而导致蛋白的回收率和纯度下降。因此，本发明针对由人白细胞介素-15、人白细胞介素-15受体以及表皮生长因子受体抗体三种蛋白融合而成的抗体融合蛋白IL15-IL15Rα-aEGFR，寻找一种能够使蛋白稳定的纯化方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公开了一种白细胞介素15及其受体-单克隆抗体融合蛋白的纯化贮存方法，对洗脱液以及贮存液的组分及最适pH进行了改进，以解决抗体融合蛋白在纯化过程中不稳定以及回收率低的问题。