[发明专利]基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法及装置

权利要求书

1.基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法，其特征在于,包括如下流程：

A、样品提取物制备：从黄颡鱼中取得可食用的鱼肉然后用蒸馏水洗净；用高速匀浆器Ultra Turrax以6000g的离心力进行均质；取5g鱼肉匀浆放入50mL离心管中，加入25ml乙腈、水、乙酸混合液和500mg中性氧化铝，混合得混合物；将混合物剧烈震动10分钟后在4℃下9000g离心10分钟；提取离心后的上清液得样品提取物；高速匀浆器Ultra Turrax采用德国伊卡-沃卡的T25；乙腈、水、乙酸混合液中各成分体积比乙腈：水：乙酸为9:1:0.1；

B、KCC-1制备：将0.6g尿素和1.1gCPB完全溶解在30ml的水中；添加30mL环己烷和0.94mL2-丙醇；逐滴添加共3mL的正硅酸乙酯，得B2混合物；在70℃下搅拌B2混合物20小时，得B3溶液；将B3溶液在8000g下离心10分钟；依次用丙酮、去离子水和无水乙醇进行洗涤；真空下干燥12小时后在500℃下煅烧4小时获得KCC-1；

C、氧化石墨制备：取3.0g石墨片与18.0g高锰酸钾混合，并添加400ml浓H2SO4、H3PO4混合液，冷却至室温，得C1混合物，浓H2SO4、H3PO4混合液中各成分体积比H2SO4：H3PO4为9:1；将C1混合物倒入冰上并用5mL 30％的H₂O₂淬火，得C2混合物；将C2混合物在8000g下离心30分钟并取其固体残留物，得C3残留物；将C3残留物在去离子水中透析除盐，最后冻干过夜得氧化石墨；

D、G/KCC-1复合材料制备：将氧化石墨分散在水中并进行超声处理，得氧化石墨均匀分散体溶液；在氧化石墨均匀分散体溶液中以1:1的质量比添加KCC-1，得D2混合物；将D2混合物在120℃下剧烈搅拌2小时，得D3品；用50％体积浓度的乙醇水溶液洗涤D3品，得G/KCC-1复合材料；G/KCC-1复合材料即为石墨烯/KCC-1复合材料；

E、G/KCC-1PT-SPE：使用10％甲醇激活并调节G/KCC-1尖端；将样品提取物吸入G/KCC-1尖端并分配回样品管中至少20次重复循环；使用3ml的1％乙酸和3mL的2％水甲醇清洗G/KCC-1尖端；在G/KCC-1针尖上喷洒1mL5％氢氧化铵并在乙腈中循环执行10次，得洗脱液；将洗脱液通过0.22μm膜过滤器过滤，得待分析样品；

F、UPLC-MS/MS分析；

G、数据统计分析：使用单因素方差分析对经UPLC-MS/MS分析获得的数据进行分析并与相应标准相匹配，得出黄颡鱼中蛋白酶抑制剂的种类及含量。

2.根据权利要求1所述的基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法，其特征在于，步骤F所述的UPLC-MS/MS分析，其具体步骤如下：

在Halo-fused core C18柱使用流动相A和B以0.6mL·min^–1的流速冲洗；采用梯度洗脱模式，起始为5％A，5％A–100％A 8min，100％A 9min和5％A 10min；进样量为2μL，总运行时间为12min；柱温和样品盒分别设置为30℃和4℃；

Halo-fused core C18柱规格为100mm×2.1mm，2.7μm粒径；

流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的甲酸水溶液；

UPLC的洗脱液通过负离子模式下的电喷雾电离离子源直接引入质谱仪；用氮气作气体动力，帘式气体压力为30磅/平方英寸、GS1为40磅/平方英寸和GS2为40磅/平方英寸；电压参数具体为，分散电位和入口电位，其值分别为-60eV和-10eV。