[发明专利]基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法及装置

说明书

本发明公开了基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法及装置,测定方法为：样品提取物制备、G/KCC‑1复合材料制备、G/KCC‑1PT‑SPE、UPLC‑MS/MS分析、数据统计分析；测定装置为：包括液相色谱‑质谱联用仪和色谱柱固定支架。本发明提供基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法，能高选择性、灵敏、准确的分离并定量测定黄颡鱼中蛋白酶抑制剂，而且G/KCC‑1具有吸附剂用量少、有机溶剂用量少、操作简便、吸附容量大、重现性好的优点，是分离富集复杂样品中蛋白酶抑制剂的有效吸附剂，采用本发明进行检测所需的样品量及消耗量均显著低于现有的方法，更有助于对鱼类或鱼制品中蛋白酶抑制剂进行食品质量监测，确保食品的安全。

技术领域

本发明涉及黄颡鱼成分检测领域，特别是基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法及装置。

背景技术

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)属于水飞蓟形目中的蓝鲶科，是一种商业上重要的水产养殖鱼类，深受亚洲消费者的喜爱。在中国，黄颡鱼养殖已成为一个新兴产业，2018年的年产量为48万吨，由于其优良的肉质感官品质和丰富的营养，黄鲶养殖呈持续增长趋势。据报道，黄颡鱼含有丰富的粗蛋白质、矿物质元素、多不饱和脂肪、维生素E，必需氨基酸比例较高。然而，国内外市场需求的增加促使黄鲶在密集条件下养殖(约3000kg/667m2)。由于传染病的危害日益严重，养殖黄颡鱼的经济损失巨大。

沙奎那韦、利托那韦和茚地那韦是有效的选择性蛋白酶抑制剂，通常用作抗病毒药物。蛋白酶抑制剂的工作原理是，如果病毒侵入易感宿主细胞，凭借宿主细胞的酶系统、原料和能量复制其核酸，并在宿主细胞核糖体的帮助下翻译病毒的蛋白质，它就能独立生存。这些药物可以与蛋白酶分子活性中心上的化学基团结合，使蛋白酶活性下降甚至失活，达到抵抗病毒的作用。

早在2005年，国家农业部就已经禁止在动物养殖中使用人类抗病毒药物。然而，许多非法企业仍然将其用于农业和水产养殖业的感染预防和疾病治疗，以缩短养殖周期，迅速获得经济效益。长期大量使用这些药物会导致动物中毒，诱发病毒株的变异，严重威胁人类健康。因此，建立一种高效的蛋白酶抑制剂的检测方法是非常重要和迫切的。

准确有效地定量蛋白酶抑制剂仍然是一个挑战，并已引起科学家们对开发检测此类化合物的新技术的兴趣。例如，有人基于液相色谱分析和双紫外检测(Poirier、Robidou和Jaillon，2002)开发了一种选择性和灵敏的同时检测蛋白酶抑制剂的方法(洛比那韦、利托那韦、萨奎那韦、奈非那韦、安普瑞那韦和印地那韦)。有人提出了一种定量分析方法，使用选定的反应监测定量模式和交叉验证，通过基质辅助激光解吸/电离检测人血浆中的沙奎那韦(Wagner、Varesio和Hopfgartner，2008)。有人通过反向酶谱法在三(羟甲基)氨基甲烷三联碱缓冲系统中检测蛋白酶抑制剂(LeKatunuma，2004)。

然而，现有的这些检测方法仍然不够灵敏，无法检测复杂样品中低水平的蛋白酶抑制剂及其含量，不能满足日常监测的需要，从而无法确保食品安全。

发明内容

本发明的目的在于，提供基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法及装置。本发明具有能检测足够灵敏，能检测复杂样品中低水平的蛋白酶抑制剂及其含量，能满足日常监测需求最终确保食品安全的优点。

本发明的技术方案：基于石墨烯的黄颡鱼蛋白酶抑制剂含量测定方法，包括如下流程：

A、样品提取物制备：蒸馏水清洗黄颡鱼可食用部分后用高速匀浆器以6000g的浓度均质，最后以改良的QuEChERS方法提取上清液作为样品提取物；

B、KCC-1制备：以改良法制备KCC-1；

C、氧化石墨(GO)制备：采用改进的Hummer发制备GO；

D、石墨烯/KCC-1(G/KCC-1)复合材料制备：采用水蒸气诱导内水解法制备G/KCC-1复合材料；