[发明专利]合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用

说明书

本发明涉及一种合成N‑乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用。该基因工程菌为含有氨基葡萄糖合成酶基因glmS、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的重组谷氨酸棒状杆菌和6p‑乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB，且其经过了敲除GlcNAc逆转运途径、分解代谢途径和竞争代谢途径的相关基因的的底盘微生物改造。该基因工程菌安全无毒性，能够利用微生物发酵法高产GlcNAc，且批次稳定，生产成本较低，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于基因重组技术领域，涉及一种合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程 菌及其应用。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖又称N-乙酰葡糖胺(N-acetyl-D-(+)-glucosamine， GlcNAc)，分子式C8H15NO6，分子量221.21，是葡萄糖的2位羟基被乙酰氨基 取代后的产物，是一种具有生物活性的功能单糖，是生物体内多种多糖的组成单 位，尤其是甲壳类动物的外骨骼含量最高。GlcNAc是合成双歧因子的重要前体， 在生物体内具有许多重要生理功能；其具有软骨损伤修复、再生功能；也可改善 免疫调节，刺激抗肿瘤免疫应答，具有抗肿瘤和消炎功能；同时，作为新型生化 药品，它和氨基葡萄糖(GlcN)是糖胺聚糖结构单元的前体，包括人体内的透明 质酸和硫酸软骨素，长期以来一直被用作治疗骨关节炎和保持软骨和关节健康的 药物和营养品；其在药品和保健品领域有着广泛的应用。

GlcNAc的生产方法主要有化学法、酶催化法和微生物发酵法。化学法是通 过酸水解甲壳素得到乙酰氨糖，但该方法污染大，且产品不适用于海鲜过敏症患 者。与化学法相比，酶催化法和微生物发酵法属于环境友好型生产方法，但是酶 催化几丁质降解合成乙酰氨糖，受制于底物虾蟹壳预处理困难、关键酶活性低、 产物分离纯化困难，导致规模化生产难度较大。微生物发酵法生产GlcNAc是目 前最具前景的方法，其在代谢工程技术和合成生物学技术的推动下，发展潜力越 来越大，优势日益明显。

目前，利用微生物发酵法生产GlcNAc的主要菌株为大肠杆菌和酵母。早在 2005年，MingDe Deng等人利用大肠杆菌，通过代谢工程改造和发酵过程优化， 可以产生110g/LGlcNAc，然而由于大肠杆菌在发酵过程中会分泌内毒素，生产 的氨基葡萄糖并不能满足食品级需求。近几年来已报道的利用酵母发酵生产 GlcNAc，最高产量仅为3g/L，而且发酵周期长达135小时，生产强度较低。

因此，目前存在的问题是需要构建一株合成GlcNAc的无毒性安全菌株，其 能够利用微生物发酵法高产GlcNAc，生产成本较低。

发明内容

本发明的目的之一是针对现有技术的存在的缺陷提供一种合成GlcNAc的基 因工程菌，该菌株安全无毒性，能够利用微生物发酵法高产GlcNAc，生产成本 较低。

本发明的目的之二是提供上述合成GlcNAc的基因工程菌在合成GlcNAc中 的应用。

为此，本发明提供了一种合成GlcNAc的基因工程菌。

根据本发明第一方面的实施方式，所述合成GlcNAc的基因工程菌为含有氨 基葡萄糖合成酶基因glmS、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p-乙酰氨糖特异 性的磷酸酶基因yqaB的重组谷氨酸棒状杆菌。

在本发明的一些实施例中，所述氨基葡萄糖合成酶基因glmS来源于枯草芽 孢杆菌168，所述氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1来源于秀丽隐杆线虫，所述6p- 乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB来源于大肠杆菌K12。

在本发明的另一些实施例中，所述基因工程菌还包含在氨基葡萄糖转乙酰基 酶基因gna1前插入的融合标签，所述融合标签包括HA、CMYC、Flag和STREPII 中的一种或几种，优选为HA。