[发明专利]乏氧响应型比率探针合成方法及其应用

权利要求书

1.一种乏氧响应型比率探针合成方法，其特征在于，采用具有内部疏水空腔及表面修饰位点丰富的纳米材料，修饰乏氧响应型荧光基团、内参荧光基团和肿瘤识别基团，获得乏氧响应型比率探针；

其中，所述内部疏水空腔及表面修饰位点丰富的纳米材料，包括脂质体、二氧化硅微球和树枝状大分子中的一种或多种；

所述乏氧响应型比率探针，其制备方法具体为：

步骤S100，通过将内参荧光基团选取花青素荧光染料Cy5-NHS，与纳米材料选取第五代聚酰胺-胺树枝状大分子PAMAMG5的外表面氨基共价结合成为PG5-Cy5；

步骤S200，将乏氧响应型荧光基团选取硝基还原酶响应型荧光分子分子包封于PG5-Cy5的疏水空腔，形成；

步骤S300，将肿瘤识别基团选取寡透明质酸LWHA修饰于外层，合成。

2.根据权利要求1所述的乏氧响应型比率探针合成方法，其特征在于，所述乏氧响应型荧光基团，包括ROS、pH和硝基还原酶响应型荧光分子中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的乏氧响应型比率探针合成方法，其特征在于，所述内参荧光基团，包括Cy5.5，IRDye800，ICG中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的乏氧响应型比率探针合成方法，其特征在于，所述肿瘤识别基团，根据目标肿瘤的不同选取靶向性抗体、多肽或核苷酸中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的乏氧响应型比率探针合成方法，其特征在于，在步骤S100-步骤S300中，Cy5-NHS与PAMAMG5的摩尔比不低于1:1，与PAMAMG5的摩尔比不低于10:1，LWHA与PAMAMG5的摩尔比不低于1:1。

6.根据权利要求1所述的乏氧响应型比率探针合成方法，其特征在于，所述步骤S100，具体为：

将0.7mg花青素荧光染料Cy5-NHS溶解于1mL 的1:1的丙酮-甲醇溶剂中，获得Cy5-NHS溶液；

将280mg 的PAMAMG5溶解于5mL 的pH9.0的硼酸盐缓冲溶液中，获得PG5溶液；

将所述Cy5-NHS溶液缓慢滴入所述PG5溶液，并在室温避光搅拌24小时，并将反应物转移到透析袋中透析2天进行去除游离Cy5-NHS、丙酮和甲醇的操作，冻干获得PG5-Cy5。

7.根据权利要求6所述的乏氧响应型比率探针合成方法，其特征在于，所述步骤S200，具体为：

将2mg的硝基还原酶响应型荧光分子溶解于200L 的1:1的丙酮-甲醇溶液中，在冰浴中混合2小时，获得溶液；

将溶液进行5500rpm、4°C超滤操作，直至滤液无吸收峰，获得溶液。

8.根据权利要求7所述的乏氧响应型比率探针合成方法，其特征在于，所述步骤S300，具体为：

将6mg 的LWHA溶解于2mL的，并加入溶液中，并通过Vortex震荡30秒，4°C静置1小时，得到溶液。

9.一种乏氧响应型比率探针的应用，其特征在于，采用如权利要求1-8任一项所述的方法合成的乏氧响应型比率探针在目标细胞中应用；

通过恒定发光荧光基团对探针浓度进行标定；

获取乏氧响应型荧光基团与恒定荧光基团信号的比值信号；

通过所述比值信号消除探针浓度对响应信号的影像，获得与硝基还原酶浓度线性相关的比值信号，进而完成对乏氧的定量检测。