[发明专利]利用单碱基基因编辑技术突变OsWaxy基因改良水稻直链淀粉含量的方法

说明书

本发明提供一种利用单碱基基因编辑技术突变OsWaxy基因改良水稻直链淀粉含量的方法。通过构建腺嘌呤碱基转化工具ABEs载体靶向OsWaxy基因特定序列，以水稻为转化材料，使OsWaxy蛋白的单个或多个氨基酸突变，突变体的直链淀粉含量测定结果显示，OsWaxy蛋白单个或多个氨基酸突变能够导致突变体内胚乳直链淀粉含量发生显著改变，说明通过单碱基基因编辑技术改变OsWaxy蛋白的单个或多个氨基酸能够显著改良水稻的直链淀粉含量。本发明提供的非转基因纯合OsWaxy基因突变体将成为非常有价值的种质资源，可用于改良水稻品种的直链淀粉含量，为利用单碱基基因编辑技术快速改良水稻品种的直链淀粉含量提供有效策略。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，具体地说，涉及一种利用单碱基基因编辑技术突变OsWaxy基因改良水稻直链淀粉含量的方法。

背景技术

随着人民群众生活水平的日益提高，对大米的消费逐渐转向优质化和专业化。目前，行业内公认的影响大米食味品质的最重要因素为直链淀粉含量，它与米饭质地的硬度、凝聚性和粘度等特性密切相关。在优质化方面，在农业部新标准NY/T 593-2013食用稻品质定级指标中，籼稻和粳稻的一级米都要求直链淀粉含量在 13％-18％之间，籼稻二级米要求在13％-20％，而三级米则在13％-22％之间。因此，直链淀粉含量是国家评价优质食用稻的重要关键性指标。与之对应的，保证直链淀粉的含量在13％-20％之间也是水稻优质化育种方向的重要目标。而随着大米消费专业化的发展，对大米直链淀粉含量的需求更加多样化，如专门用于做米粉的大米，或专门供糖尿病患者或高危人群食用的高抗性淀粉大米，甚至是南北方人民口感的差异，都要求在水稻育种中，能够快速精准调整直链淀粉含量，开发能够调整不同直链淀粉含量的生物技术。因此，开发精准调整直链淀粉含量的生物技术手段具有重要的商业价值。

OsWaxy基因位于第6染色体的短臂，早在1990年就已被克隆，是决定直链淀粉合成的关键酶(Wang et al.,1990)。过表达或降低OsWaxy基因表达将导致贮藏器官中 OsWaxy基因酶活和直链淀粉含量明显上升或下降。通过突变体实验也发现，缺失 OsWaxy基因将获得直链淀粉缺失糯稻。OsWaxy基因表达调控的机制目前还不完全清楚。除基因结构发生改变，影响其表达和蛋白功能外，可能受多个水平、多种因子的协同调控。OsWaxy基因在自然界存在多种等位基因，在非糯品种中，OsWaxy基因分化为OsWaxy^a和OsWaxy^b两种等位基因，其中，野生稻全为OsWaxy^a，籼稻以OsWaxy^a为主，直链淀粉含量较高；粳稻基本为OsWaxy^b，直链淀粉含量较低。序列分析表明，与OsWaxy^a相比，OsWaxy^b的第1内含子5'端剪切处发生由GT→TT的突变，导致第1内含子剪接效率降低及剪接不正常，从而使其转录本含量降低(Hirano et al.,1998；Isshiki et al.,1998)。此外，OsWaxy基因在栽培水稻品种中存在多个等位基因，不同等位基因可能造成该基因表达值或酶活有显著差异，从而导致栽培水稻各个品种中直链淀粉含量差异很大。Wxⁱⁿ突变点位于第6外显子第62位碱基由A突变为C，导致编码的酪氨酸突变为丝氨酸，Wxⁱⁿ中该位点的突变可能改变了基因酶活，使得含有该等位基因品种直链淀粉含量降低。Wx^mq编码区域有两个位置发生突变，分别导致了第4外显子编码的第158位氨基酸由精氨酸突变为组氨酸，,5外显子编码的第191位氨基酸由酪氨酸突变为组氨酸，这两处突变显著降低了该品种中直链淀粉含量。可见，无论是人工突变还是自然突变产生的基因突变，OsWaxy基因编码区的点突变有可能使基因活性降低或基因表达值变化、从而影响直链淀粉的合成。