[发明专利]荔枝转基因体系的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种荔枝转基因体系的构建方法及其应用。通过本发明的构建方法在荔枝实生苗上成功构建了荔枝转基因体系，在荔枝的转基因技术和基因功能验证具有重要的应用价值，为荔枝的品种选育和品种改良提供的研究工具。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种荔枝转基因体系的构建方法及其应用。

背景技术

荔枝（Litchi chinensisSonn.）是原产于我国的重要经济常绿果树。荔枝营养丰富，具有优良的果实品质，因而备受消费者的喜爱。但是荔枝不耐贮运，并且稳产性不高，所以急需建立荔枝转基因体系，促进品种的选育和品种改良的进程。但目前的研究中，尚未报道荔枝实生苗上成功构建转基因体系。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种荔枝转基因体系的构建方法。

在一些实施方式中，所述荔枝转基因体系的构建方法包括以下步骤：

步骤a：荔枝种子消毒后于无菌培养基中培养获得荔枝实生苗；

步骤b：活化农杆菌得到侵染用农杆菌菌液，所述农杆菌中携带有目的基因；

步骤c：使用所述农杆菌菌液创伤侵染荔枝实生苗；

步骤d：恢复培养后荔枝实生苗上获得到转基因根。

在一些实施方式中，所述无菌培养基为1/2 MS培养基。

在一些实施方式中，所述荔枝实生苗是指苗期为20-30天的荔枝实生苗；优选地，所述荔枝实生苗是指苗期为25天的荔枝实生苗。

在一些实施方式中，所述农杆菌为Ar.Qual发根农杆菌。

在一些实施方式中，所述农杆菌中含有筛选质粒；优选地，所述筛选质粒中含有报告基因RUBY；更优选地，所述报告基因RUBY由35S启动子引导表达。

报告基因RUBY中包括甜菜碱生物合成基因 CYP76AD1、DODA和葡萄糖基转移酶，这三个基因通过2A 肽相连。当其表达时可以产生甜菜碱生物合成所需的所有酶，可用于来追踪基因表达或可视化转基因。关于报告基因RUBY的描述详见：He, Yubing , Zhang, Tao ,Sun, Hui , Zhan, Huadong , Zhao, Yunde. A reporter for noninvasivelymonitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research,2020, 7(1)。本发明中通过在农杆菌中转入含有报告基因RUBY的筛选质粒，可以非常简便直观地确认转基因是否成成功。

在一些实施方式中，所述步骤b具体为：将含有目的基因的农杆菌加入TY液体培养基，于28℃振荡培养2小时，离心重悬后，将菌液涂布在含有链霉素、卡那霉素的TY固体培养基上，28℃培养2天，挑单菌落于含有链霉素、卡那霉素和乙酰丁香酮的TY液体培养基中，28℃、220 rmp振荡培养得到侵染用农杆菌菌液。

在一些实施方式中，所述农杆菌菌液的OD₆₀₀值为0.5-0.7；优选地，所述农杆菌菌液的OD₆₀₀值为0.6。

在一些实施方式中，所述步骤c具体为：使用注射器吸取所述农杆菌菌液创伤侵染荔枝实生苗的茎，然后避光静置。

在一些实施方式中，所述步骤c具体为：使用注射器吸取所述农杆菌菌液创伤侵染荔枝实生苗的茎，然后避光静置30-45min，然后再次使用注射器吸取所述农杆菌菌液创伤侵染荔枝实生苗的茎上同一伤口，然后避光静置1-2h。