[发明专利]一种人T淋巴细胞的慢速冻存方法

说明书

本发明公开了一种人T淋巴细胞的慢速冻存方法，其包括以下步骤：(1)将包含人T淋巴细胞与细胞冻存液的冻存管置于冷却剂中冷却；(2)用经液氮预冷的金属接触所述冻存管的管壁对侧进行置核；(3)将所述冻存管置于所述冷却剂中平衡；(4)将所述冻存管移至低温设备中，以5～50℃/min的速率降温至‑50℃～‑55℃。本发明控制冻存液降温过程中的过冷度，结合降温速率冻存人T淋巴细胞，可达到较好的冻存效果，降低了实际操作中出现质量控制偏差的概率。本发明还解决了细胞冻存液的细胞毒性这一难题，提供了低或无DMSO保护剂组合配方，其渗透压远低于市面上使用的其他细胞冻存液，对细胞或人体伤害更小。

技术领域

本发明属于细胞领域，具体涉及一种人T淋巴细胞的慢速冻存方法。

背景技术

癌症是威胁全人类生命安全的恶性疾病之一，其发病率并未随着人们生活条件的改善而下降，反而逐年呈上升趋势。随着基因载体技术、基因编辑技术的发展，细胞治疗已经从科学尝试迅速走向了临床应用。2017年，美国宾夕法尼亚大学和瑞士诺华公司共同研发的首个CAR-T疗法产品Kymriah(用于治疗复发或难治性急性淋巴细胞白血病)正式通过美国食品药物监督管理局(FDA)的上市批准。自此，全球细胞治疗的临床试验数量呈现爆发式增长。未经修饰的人T淋巴细胞对于CAR-T细胞的生产和制备至关重要，其长期保存也成为CAR-T细胞生产制备或者科学研究中的关键技术之一。

低温保存(Cryopreservation)是目前为止最为有效的一种细胞长期保存方法。低温能有效地抑制细胞内部生化反应的速率，从而实现长期的保存。根据储存温度的不同，细胞可以进行短期或长期的保存，理论认为在液氮中储存的细胞可以保持其生物性状经历几个世纪而不改变。细胞在低温保存的过程中会由于温度的改变以及水分子的结晶受到一系列低温损伤。首先在降温至相变温度之前，一些对温度敏感的细胞比如公牛和野猪的精子等会由于膜相变产生不可逆的细胞损伤，这种损伤被称之为冷冲击损伤(Cold shockinjury)。其次随着温度的降低，细胞外部的溶液会出现过冷现象，即溶液在低于相变转换温度下发生结晶的现象。过冷的一个坏处是不利于产品冻存质量的控制，如下图中蓝色的降温曲线显示，降温过程中冻存液的过冷是一个随机行为，即使采用相同的冻存程序，每个样品的降温过程都是随机的，因此控制冻存液的过冷对于细胞药物的冻存质量控制很关键。

过冷的另一个后果是冰晶的快速生长，会使得渗透性较差的细胞受到胞内结晶损伤。随着温度进一步降低，冰晶在细胞外溶液中形成，并且随着降温速率的不同，细胞会受到溶液损伤(Solution effects injury)或胞内冰损伤(Intracellular ice injury)。这种由于降温速率的不同而产生的两种不同类型的低温损伤被美国学者Peter Mazur总结为两因素假说。最佳的降温程序应该在最大程度抑制胞内冰形成的同时，不对细胞造成过多的溶液损伤。此外，细胞在低温保存过程中还会受到各类机械损伤(mechanical damage)。最后，保护剂毒性损伤(Cryoprotective agents toxicity)也是细胞低温损伤的重要来源。低温保护剂的毒性分为高渗毒性和代谢毒性两类，前者是因为低温保护剂通常是在较高的浓度下工作的，而细胞在高渗的环境中会受到损伤，尤其是在玻璃化冻存中，高浓度的低温保护会成为造成细胞损伤的主要因素之一；而代损伤往往是针对渗透性的低温保护剂而言的，渗透性的保护剂会渗透进如胞内影响细胞的正常生理代谢活动，比如影响蛋白质的构象，线粒体等细胞器的正常功能等。