[发明专利]一种松材线虫快速检测试纸卡及其制备和使用方法

权利要求书

1.一种松材线虫快速检测试纸卡的制备方法，其特征在于松材线虫快速检测试纸卡包括卡壳和试纸条，试纸条底部为底板，底板上依次设置样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的硝酸纤维素膜上设置C线和T线；试纸条装配在卡壳内，卡壳上设有加样孔和观察孔，加样孔与粘贴样品垫相对，观察孔与硝酸纤维素膜、C线和T线相对；金标垫上涂覆有标签抗体，该标签抗体为胶体金标记的特异性鼠抗单克隆抗体；T线处涂覆有包被抗体，该包被抗体为特异性鼠抗单克隆抗体；C线处涂覆有羊抗鼠IgG二抗；所述的底板上从前端到后端依次设置样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；样品垫的后端与金标垫的前端交叠放置，硝酸纤维素膜的前端与金标垫的后端交叠放置，吸水纸的前端与硝酸纤维素膜的后端交叠放置；所述的C线的轴线与硝酸纤维素膜的轴线垂直；T线的轴线与硝酸纤维素膜的轴线垂直；T线位于C线和金标垫之间；

方法按以下步骤进行：

(1)将0.5～2g氯化金粉末溶于100mL超纯水中，制成氯化金溶液；将0.1～0.5g柠檬酸三钠溶解于10mL超纯水中，制成柠檬酸三纳溶液；

(2)将1.0～2.0mL氯化金溶液加入到100mL超纯水中，再搅拌加热至沸腾，然后加入1.0～1.5mL柠檬酸三钠溶液，在保持沸腾的条件下继续搅拌至全部溶液呈透明酒红色，制成胶体金溶液；

(3)将1mL胶体金溶液用K₂CO₃溶液调节pH值为5.0～8.0，再加入5～50μg标签抗体，搅拌混合反应15～30min，再加入BSA搅拌混合反应15～30min，制成标签抗体-胶体金溶液；BSA在标签抗体-胶体金溶液中的质量浓度为1～10％；

(4)将Tris、海藻糖和蔗糖溶于水中，用盐酸调节pH值为5.0～9.0，制成标签抗体稀释液；标签抗体稀释液中Tris的浓度为0.01～0.1M，海藻糖的质量浓度为1～10％，蔗糖的质量浓度为1～10％；

(5)将标签抗体-胶体金溶液离心至少30min，然后分离去除上清液，剩余的沉淀用0.05～0.5mL标签抗体稀释液溶解，制成标签抗体-胶体金工作液；

(6)将Tris、PVP、BSA和蔗糖溶于水中，用盐酸调节pH值为5.0～9.0，制成金标垫处理液；金标垫处理液中Tris的浓度为0.01～0.1M，PVP的质量浓度为1～10％，BSA的质量浓度为1～10％，蔗糖的质量浓度为1～10％；

(7)将Tris、PVP、Tween-20和蔗糖溶于水中，用盐酸调节pH值为5.0～9.0，制成玻纤处理液；玻纤处理液中Tris的浓度为0.01～0.1M，PVP的质量浓度为1～10％，Tween-20的质量浓度为1～5％，蔗糖的质量浓度为1～10％；

(8)将玻璃纤维用玻纤处理液浸没2～8h，然后烘干，制成样品垫；将聚酯膜用金标垫处理液浸没2～8h，然后烘干，制成金标垫；

(9)将标签抗体-胶体金工作液涂覆在金标垫表面，使其构成标签抗体金标垫；将包被抗体工作液涂覆在硝酸纤维素膜的T线处，将羊抗鼠IgG二抗溶液涂覆在硝酸纤维素膜的C线处，其中包被抗体工作液的浓度为0.1～2mg/mL，羊抗鼠IgG二抗溶液的浓度为0.1～2mg/mL；

(10)在底板上依次粘贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，经切条机裁切，制成试纸条；

(11)将试纸条装配到卡壳中，制成松材线虫快速检测试纸卡；

特异性鼠抗单克隆抗体的制备方法按以下步骤进行：

(a)将松材线虫接种在长有灰葡萄孢的PDA培养基上，在22～28℃条件下培养5～10天；

(b)用漏斗法分离处培养获得的松材线虫，取1～5mg放在冰的研钵中，加入200～500μL质量浓度为0.9％的生理盐水，再将松材线虫研磨至形成浑浊黄色液体，获得线虫液；

(c)将线虫液在10000～12000rpm条件下离心5～15min，收集上清液作为抗原；

(d)将抗原与弗氏完全佐剂按1:1等体积混合后充分乳化，制成免疫注射剂；将免疫注射剂向BALB/c雌性小鼠进行腹腔注射，获得注射后小鼠；注射量按50～100ug抗原/只；BALB/c雌性小鼠的体重为18～20g，鼠龄为6～8周；

(e)将注射后小鼠培养4周，再次注射免疫注射剂，获得二次注射小鼠，其免疫注射剂为：将抗原与弗氏不完全佐剂按1:1等体积混合后充分乳化得到；注射剂用量与步骤(d)用量相等；

(f)将二次注射小鼠培养2周，按步骤(e)的方式再次注射免疫注射剂，注射量按步骤(d)两倍的剂量注射，获得三次注射小鼠；

(g)将三次注射小鼠培养3天后，取出小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞；

(h)将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞按质量比为5～10﹕1混合，置于无血清的RPMI-1640培养基中混匀，然后在800～1200rpm的条件下离心5min，去除上清液部分，获得沉淀细胞；

(i)将0.5～0.8mL融合剂加入到(h)中所得沉淀细胞中，融合1～5min，然后置于无血清的RPMI-1640培养基中终止融合，在37±0.5℃和800～1200rpm的条件下离心5min，去除上清液部分，获得融合细胞；所述的融合剂为质量浓度为30～50％PEG溶液；

(j)将融合细胞用HAT培养基重悬；获得的悬液分装到96孔细胞板中，在37±0.5℃条件下，用5％CO₂培养箱培养5天，然后用HAT培养基换液培养5天，再用HAT培养基半量换液培养5天，再用按体积百分比含1％HT的培养基换液培养；

(k)融合细胞覆盖96孔细胞板孔底10～50％时，用间接ELISA法筛选阳特异性阳性孔；

(l)采用有限稀释法进行3次克隆，选择两株呈单个克隆生长的细胞株继续克隆培养，直至抗体分泌阳性率大于95％，将其扩大培养，得到两株单克隆抗体细胞株；

(m)将两株单克隆抗体细胞株分别置于10％FBS中的DMEM培养基中，分别接种于6孔培养板，分别在37±0.5℃条件下，用5％CO₂培养箱培养2天，分别收集上清液；

(n)将两个上清液各取15mL在8000～12000rpm条件下离心5～10min，经protein A+G琼脂糖过柱，重复2～3次，再用30～50mL wash buffer清洗柱子；向接收用离心管加入0.1mL浓度100mM的Tris，再用Elution buffer冲洗柱子；每个接收用离心管再接0.9mL Elutionbuffer；用BCA法测各个接收管中的溶液的蛋白浓度，将其中浓度最高的两个接收管中的溶液合并起来；用带滤膜的MILLIPORE离心管将溶液离心浓缩，再用TBS清洗2次，使溶液浓缩到0.5mL，分别制成鼠抗单克隆抗体的标签抗体和鼠抗单克隆抗体的包被抗体，此过程所制作的单克隆抗体即为特异性鼠抗单克隆抗体。