[发明专利]一种松材线虫快速检测试纸卡及其制备和使用方法

说明书

一种松材线虫快速检测试纸卡及其制备和使用方法，包括卡壳和试纸条，试纸条底部为底板，底板上依次设置样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的硝酸纤维素膜上设置C线和T线。制备方法包括制成标签抗体‑胶体金工作液，标签抗体金标垫，将标签抗体‑胶体金工作液涂覆在金标垫表面，使其构成标签抗体金标垫；将包被抗体工作液涂覆在硝酸纤维素膜的T线处，将羊抗鼠IgG二抗溶液涂覆在硝酸纤维素膜的C线处；使用方法是将液体状的待测样品滴加2～3滴于加样孔内，室温放置5～10min，观察C线处和T线处。本发明的方法操作简单，不需要专门的仪器设备，可方便的于林间等现场直接进行检测。

技术领域

本发明属于快速检测技术领域，特别涉及一种松材线虫快速检测试纸卡及其制备和使用方法。

背景技术

松属植物作为常见的绿化树种，用途十分广泛，可作为工业原料、日常用品原料等。然而，植物虫害时刻威胁着松属植物的生长。

传统松材线虫的检验检疫方法是用贝尔曼漏斗法分离出线虫后，在光学显微镜下依据线虫的形态特征来进行鉴定；这种方法费时费工，需要 2 个工作日，不适应口岸检疫快速通关的要求。而松材线虫的近缘种拟松材线虫在形态上与松材线虫极其相似，常单生或与松材线虫混居于松木样品中，给形态学鉴定造成困难，使松材线虫的检疫和防控工作受到严重影响， 特别是口岸检疫。随着分子生物学技术的发展，PCR 检测技术逐渐成为有害生物检测，特别是病原检测的利器，核糖体基因 rDNA 就是目前分子系统学中普遍采用的分子标记之一。松材线虫的 rDNA 基因由保守的 18S、5.8S 和 2S 基因编码区以及其间的非编码间隔区，ITS1 和 ITS2 组成，由于 ITS 区为非编码区，不编码功能基因，因此变异程度较高，是对松材线虫和拟松材线虫进行分子鉴定的理想区域。近年来，许多学者也利用松材线虫与拟松材线虫的ITS1 及 ITS2 区的核酸序列差异建立了许多分子鉴定体系，但是这些方法仍然是要用贝尔曼漏斗法分离线虫后进行检测。虽然此后的分子检测都可以在一个工作日内完成，但加上分离过程，仍然需要个 2 工作日才能完成，并没有达到口岸检疫快速通关的要求。

传统鉴定的方法是通过形态学鉴定，但由于形态常受到环境和地理条件的影响，有时并不可靠，特别是在种间进行鉴定时，常难以找到合适的鉴定特征。生殖器官的构造是低等动物分种的重要依据，而松材线虫和拟松材线虫有相似的雄虫交合刺远端膨大和雌虫阴门盖两个重要特征，所以通常选用雌虫尾型及雄虫交合伞形状作为鉴定依据。

目前，针对松材线虫检测的常见方法一般为直接观察、形态学分析，基因序列比对，缺乏能够在待测现场直接检测且灵敏度优异的技术，大大的限制针对松材线虫的检测效率；因此，开发操作简洁、快速、灵敏度优异的松材线虫检测技术，将有力的限制松材线虫病的蔓延，保护松林植被，减少经济损失。

发明内容

为解决现有技术中松材线虫的检测方法对场地、仪器、技术人员的要求较高，样本处理复杂，不适合大量筛选检测及林间快检的问题，本发明提供一种松材线虫快速检测试纸卡及其制备和使用方法。

本发明的松材线虫快速检测试纸卡包括卡壳 1 和试纸条 2，试纸条 2 底部为底板 3，底板3 上依次设置样品垫 4、金标垫 5、硝酸纤维素膜 6 和吸水纸 7，所述的硝酸纤维素膜 6 上设置 C 线 6-1 和 T 线 6-2；试纸条 2 装配在卡壳 1 内，卡壳 1 上设有加样孔 8 和观察孔 9，加样孔 8 与粘贴样品垫 4 相对，观察孔 9 与硝酸纤维素膜 6、C 线6-1 和 T 线 6-2 相对；金标垫 5 上涂覆有标签抗体，该标签抗体为胶体金标记的特异性鼠抗单克隆抗体；T 线 6-2 处涂覆有包被抗体，该包被抗体为特异性鼠抗单克隆抗体；C线 6-1 处涂覆有羊抗鼠 IgG 二抗。

上述的松材线虫快速检测试纸卡中，底板 2 上从前端到后端依次设置样品垫 4、金标垫 5、硝酸纤维素膜 6 和吸水纸 7；样品垫 4 的后端与金标垫 5 的前端交叠放置，硝酸纤维素膜 6的前端与金标垫 5 的后端交叠放置，吸水纸 7 的前端与硝酸纤维素膜 6的后端交叠放置。