[发明专利]一种发酵生产L-丝氨酸的方法

说明书

本发明公开了一种发酵生产L‑丝氨酸的方法，包括以下步骤：(1)将L‑丝氨酸生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为28‑32℃，pH为6.8‑7.2，溶氧为20‑40％，搅拌转速150‑250rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.40‑0.60时，降温至27‑29℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，诱导培养48‑52h；培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的葡萄糖浓度保持在0.5‑1.0g/L；所述补料中含有葡萄糖60‑80g/L、糖蜜40‑60ml/L、叶酸0.3‑0.5g/L；(2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，分离收集上清，即生产得到含有L‑丝氨酸的培养液。采用本发明的方法可以实现L‑丝氨酸的工业化生产，并显著提高了L‑丝氨酸的产量。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种发酵生产L-丝氨酸的方法。

背景技术

L-丝氨酸是一种能够参与细胞内众多重要活性物质代谢的非必需氨基酸。另外，作为一种重要的工业产物，L-丝氨酸在食品、精细化工及医药方面都有着广泛的应用。目前，L-丝氨酸的合成主要依赖于直接提取以及化学合成，虽然产率较高，但是这两种方法均会对环境造成一定的危害。随着代谢工程和合成生物学的发展，利用微生物反应器，通过系统调控微生物代谢途径使其大量积累某种代谢产物逐渐得到了广泛的应用。大肠杆菌作为一种模式生物，具有生长速度快、培养方法简单等优点，因而常常作为宿主菌用于微生物发酵。但是作为一种代谢中间产物，L-丝氨酸在野生型大肠杆菌中的积累量较低。

为提高L-丝氨酸的产量，已有研究对野生型大肠杆菌进行基因工程改造，但改造后的大肠杆菌在发酵过程中易出现生长抑制的现象，影响其发酵生产效果。因此，现有的发酵生产L-丝氨酸的方法仍有待进一步的改进。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种发酵生产L-丝氨酸的方法。采用本发明的方法可以实现L-丝氨酸的工业化生产，并显著提高了L-丝氨酸的产量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种发酵生产L-丝氨酸的方法，包括以下步骤：

(1)将L-丝氨酸生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为28-32℃，pH为6.8-7.2，溶氧(DO)为20-40％，搅拌转速150-250rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.40-0.60时，降温至27-29℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，诱导培养48-52h；

培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的葡萄糖浓度保持在0.5-1.0g/L；所述补料中含有葡萄糖60-80g/L、糖蜜40-60ml/L、叶酸0.3-0.5g/L；

(2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，分离收集上清，即生产得到含有L-丝氨酸的培养液。

优选的，步骤(1)中，所述L-丝氨酸生产菌由如下方法构建而成：

将大肠杆菌中的gpmA、sdaA、mtfA、pta、glyA、sdaC、serA、sstT、tdcC、aceA和cycA基因敲除，获得大肠杆菌工程菌；

将serB基因用sphⅠ和AaaI酶切处理，将serC基因用NcoⅠ和BglⅡ酶切处理，将酶切处理后的serB基因和serC基因整合到质粒PQE-N上，获得第一重组表达载体(pQE-serBC)；

将pGEX-kan质粒用ecoNⅠ和ZraⅠ双酶切，再将serAΔ197基因整合到双酶切处理后的质粒pGEX-kan上，获得第二重组表达载体(pGEX-serA)；