[发明专利]一种凋亡微囊泡及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种凋亡微囊泡的制备方法，包括：1)体外培养小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系；2)细胞汇合度达到90‑100％时，加入星形孢菌素(staurosporine，STS)诱导细胞凋亡；3)收集培养液上清液，然后通过梯度离心法分离即得到凋亡微囊泡(apoptotic vesicle，apoVs)。本发明还提供了该凋亡微囊泡及其在制备用于促进间充质干细胞成脂分化的制剂中的应用。本发明提供的凋亡微囊泡能够促进间充质干细胞成脂向分化，可以用于软组织缺损或凹陷的修复，且无明显副作用。

技术领域

本发明涉及生物组织工程技术领域，具体涉及一种可用于促进间充质干细胞成脂分化的凋亡微囊泡及其制备方法和应用。

背景技术

外伤、感染、手术或先天畸形导致的软组织缺损或凹陷在临床中十分常见。颌面部软组织缺损有先天性因素和后天性因素两大类，先天性因素最常见的是唇腭裂，后天性因素主要有外伤导致的，如交通事故、烧伤，还有感染性疾病和肿瘤占位也会导致软组织缺损。此外，乳腺良恶性病变术后乳房变形、缺如也是常见的软组织缺损类型。组织重建是颌面部及乳房的术后修复的重要部分。除上述软组织缺损之外，随着年龄的增长，人们会出现面部老态的问题，比如皱纹、面部凹陷或皮肤松弛等，都是比较常见的问题，随着人们生活水平的提高和对美的追求，如何安全有效进行面部年轻化治疗也是临床研究的热点。

自体脂肪填充、人工合成或生物性填充材料植入是软组织缺损修复和凹陷修复的常用方法。但是，自体脂肪填充可能会导致术后高吸收率、液化坏死以及供区瘢痕挛缩等情况。人工合成填充物往往会导致机体产生免疫排斥反应，而生物型填充材料降解快、易吸收，需要多次填充。因此，研发更安全、有效的脂肪再生手段极为重要。

发明内容

针对现有软组织缺损修复和凹陷修复治疗方法存在较多副作用和不足之处，本发明提供了一种安全高效促进脂肪再生的细胞外囊泡，旨在解决现有软组织缺损修复和凹陷修复治疗中因产生副作用而限制了其治疗应用的问题。

脂肪再生是指通过模拟脂肪组织发生发育的过程，从而在特定区域形成新生的脂肪组织，恢复软组织结构和功能，同时避免出现相关并发症。利用组织工程进行软组织缺损修复，可以避免填充材料植入引起的免疫排斥反应，且无需自体供区组织，就可以实现软组织再生，减少了供区创伤。

本发明提供了一种用于软组织修复的凋亡微囊泡的制备方法，包括：

1)体外培养小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系；

2)细胞汇合度达到90-100％时，加入星形孢菌素(staurosporine，STS)诱导细胞凋亡；

3)收集培养液上清液，然后通过梯度离心法分离即得到凋亡微囊泡。

在根据本发明的一个实施方案中，

步骤1)中所述小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系为RAW264.7；

优选地，体外培养的培养基为：含有10％FBS和1％青-链霉素双抗的DMEM培养基。

在根据本发明的一个实施方案中，所述STS添加量为500nM。

在根据本发明的一个实施方案中，所述梯度离心法是通过包括下述步骤的方法实现的：

a)将所述培养液上清液于4℃，以800g离心10min，取上清液，获得第一离心上清液；

b)将所述第一离心上清液于4℃、以2000g离心10min，取上清液，获得第二离心上清液；

c)将所述第二离心上清液于4℃、以16000g离心30min，取沉淀物，即得粗制凋亡微囊泡。

在根据本发明的一个实施方案中，所述梯度离心法还包括：