[发明专利]一种高产萜类化合物的米曲霉底盘菌株及萜类天然产物自动化高通量挖掘平台的搭建在审
申请号: | 202111283704.0 | 申请日: | 2021-11-01 |
公开(公告)号: | CN114134054A | 公开(公告)日: | 2022-03-04 |
发明(设计)人: | 刘天罡 | 申请(专利权)人: | 武汉大学 |
主分类号: | C12N1/15 | 分类号: | C12N1/15;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/80;C12N15/53;C12N15/31;C12N15/90;C12P5/00;C12P7/62;C12P17/02;C07D303/04;C07C69/16;C07C13/52 |
代理公司: | 武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 42222 | 代理人: | 常海涛 |
地址: | 430072 湖*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 高产 化合物 曲霉 底盘 菌株 天然 产物 自动化 通量 挖掘 平台 搭建 | ||
1.一种微生物底盘细胞,其特征在于,所述的底盘细胞含有提高所述底盘细胞生产萜类化合物能力的基因,所述基因为米曲霉来源的MVA途径基因模块的基因;所述基因是来源于米曲霉的ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1和IDI基因。
2.根据权利要求1所述的微生物底盘细胞,其特征在于,所述的微生物为真核细胞或原核细胞;优选地,所述微生物为米曲霉、大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、芽孢杆菌、构巢曲霉、黑曲霉、粗糙脉孢菌、交链格孢菌或镰刀菌;更优选地,所述微生物为米曲霉。
3.根据权利要求1所述的微生物底盘细胞,其特征在于,所述萜类化合物选自半萜类化合物、单萜类化合物、倍半萜类化合物、二萜类化合物、三萜类化合物、四萜类化合物和多萜类化合物中的一种或多种。
4.一种权利要求1所述的微生物底盘细胞的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1):建立微生物底盘菌株启动子库:筛选不同来源的启动子,通过调控GUS基因的表达,表征适用于米曲霉的启动子强弱;
步骤2):以酿酒酵母来源的甲羟戊酸途径为参照,通过序列同源性比对分析,从真菌基因组数据库中筛选出米曲霉本源的甲羟戊酸途径合成酶ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1和IDI;
步骤3):将步骤2)中筛选的米曲霉来源的甲羟戊酸途径的7个甲羟戊酸途径合成酶在步骤1)表征不同强度启动子的调控下,分别构建到不同质粒上,增加限速酶基因tHMG1表达的限速酶的拷贝数,获得所述底盘细胞。
5.一种权利要1或2所述的微生物底盘细胞的制备方法,其特征在于,包括采用CRISPR/Cas9策略,将来源于米曲霉的ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1和IDI基因,分别整合到米曲霉基因组高表达位点,增加所述限速酶基因tHMG1表达的限速酶的拷贝数,获得所述微生物底盘细胞。
6.一种高产萜类的微生物菌株,其特征在于,以权利要求1或2所述的微生物底盘细胞为出发菌株,分别过表达二倍半萜合酶基因mgcD以及共表达二倍半萜合酶基因mgcD和细胞色素P450酶基因mgcE,即得到所述高产萜类的微生物菌株。
7.一种萜类生物合成基因簇高通量自动化挖掘方法,其特征在于:包含如下步骤:
1)PCR扩增;2)质粒库构建;3)微生物菌株库构建;4)以活性为导向的化合物筛选;
优选地,所述步骤2)包括如下步骤:
a.在各个基因、启动子和终止子序列的5’-端和3’-端设计40bp的重叠序列,自动化工作站配制DNA聚合酶体系,PCR扩增获得各个片段;
b.自动化酵母组装各个片段,获得重组质粒;
c.重组质粒转化大肠杆菌,富集获得质粒库;
任选地,所述步骤3)包括如下步骤:
将步骤2)中获得的质粒库根据包含的不同的功能元件的理性组合,基于自动化平台,转化到以权利要求1或2所述的微生物底盘细胞中,获得菌株库,所述功能元件包括萜类合酶、细胞色素P450酶、酰基转移酶、糖基转移酶;
优选地,所述步骤4)包括如下步骤:
将步骤3)中获得的微生物菌株库发酵产物,作用于脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7,以一氧化氮的生成为检测指标,筛选出具有抗炎活性的萜类化合物。
8.一种倍半萜化合物,其特征在于,所述倍半萜化合物的结构选自如下结构中的一种:
9.一种权利要求8所述的倍半萜化合物在制备抗炎药物中的应用。
10.一种倍半萜合成基因簇BGC6-FgJ02895在合成权利要求8中所述的倍半萜化合物中的应用,其特征在于,所述倍半萜合成基因簇BGC6-FgJ02895包含FgJ02892基因、FgJ02895基因、FgJ02896基因、FgJ02897基因、FgJ02898基因、FgJ02899基因、FgJ02900基因、FgJ02901基因、FgJ02902基因,所述基因分别编码脱羧酶、萜类合酶、转录因子、细胞色素P450酶、乙酰转移酶、Tf、细胞色素P450酶、单加氧酶、铜离子依赖的ATP酶;
优选地,所述FgJ02892基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示;所述FgJ02895基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示;所述FgJ02896基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示;所述FgJ02897基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示;所述FgJ02898基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示;所述FgJ02899基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示;所述FgJ02900基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示;所述FgJ02901基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示;所述FgJ02902基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示。
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