[发明专利]一种高产萜类化合物的米曲霉底盘菌株及萜类天然产物自动化高通量挖掘平台的搭建

说明书

本发明公开了一种高产萜类的米曲霉底盘和高通量自动化挖掘萜类生物合成基因簇FgJ02895的方法，是针对萜类产物高产、萜类生物合成基因簇高通量异源重构和活性为导向的化合物筛选。本发明基于CRISPR/Cas9技术介导基因同源重组，在基因组中基因高表达位点整合型过表达内源MVA途径基因，建立了高产萜类的米曲霉底盘细胞，实现了mangicdiene和mangicol J产量的41倍和111倍提升。在该底盘中建立的包括PCR扩增、质粒库和菌株库构建的高通量挖掘策略，实现了基因簇FgJ02895相关产物的挖掘，并获得该基因簇的产物库。同时还能对菌株库中产生的化合物进行抗炎活性评估。

技术领域

本发明涉及天然产物生物合成技术领域，具体是指一种米曲霉高产萜类底盘的搭建以及基于该底盘菌株的萜类天然产物自动化高通量挖掘平台的搭建。

背景技术

真菌天然产物是天然药物的重要来源之一，传统的挖掘策略已助力研究人员从微生物中发现诸多具有活性的天然产物，如强效抗生素青霉素、降血脂药洛伐他汀、免疫抑制剂环孢霉素等。然而，随着越来越多的天然产物被发现，能够挖掘到新颖天然产物的难度和挑战也逐渐加大。随着生物信息学及测序技术的发展，大量真菌天然产物的生物合成基因簇信息被披露，特别是沉默基因簇，蕴藏着合成新颖天然产物的巨大潜力。为了充分释放这些天然产物生物合成基因簇的合成潜力，研究人员开发了多种策略，如同源全局或特定途径调控、外源激活子激活、CRISPR/Cas策略基因编辑沉默基因簇的表达，以及备受瞩目的异源重构策略的开发等，解锁了一系列新颖天然产物的合成机制。另外，近年新兴的基于生物信息学及计算机网络模型预测分析技术的基因组挖掘及人工染色体技术，进一步推动了天然产物生物合成领域的研究进展。虽然上述策略的开发很大程度上丰富了天然产物库，然而，在实施过程中仍存在需要解决的问题，如通量低，产量低等。

萜类化合物是含有异戊二烯单元的化合物的总称。它在自然界中广泛存在，迄今为止，人们从动物、植物以及微生物体内发现的萜类化合物超过12万种。该类化合物具有许多生理活性，被广泛应用于食品、化妆品及医药行业。本发明以真菌萜类产物为研究目标，以公认的具有生物安全性的菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)为异源表达宿主，打造了高产萜类的米曲霉底盘，建立了一个提高萜类天然产物产量的丝状真菌萜类高产底盘，搭建了一套完善的真菌萜类产物基因组自动化高通量挖掘研究方案，提高了萜类天然产物基因簇研究的通量，解决了产物产量低的问题。

发明内容

针对现有技术不足，本发明提供一种高产萜类的米曲霉底盘和萜类天然产物自动化高通量挖掘平台，具体地是涉及了高产萜类的米曲霉底盘改造及具有抗炎活性的二倍半萜化合物mangicol J的高效合成，同时涉及天然产物生物合成基因簇FgJ02895的高通量异源重构，涉及它们的功能元件的PCR扩增、质粒库构建、菌株库构建、以抗炎活性为导向的化合物筛选。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

在本发明的第一方面，本发明提供一种微生物底盘细胞，所述的底盘细胞含有提高所述底盘细胞生产萜类化合物能力的基因，所述基因为米曲霉来源的MVA途径基因模块的基因；所述基因是来源于米曲霉的ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1和IDI基因。优选地，ERG10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；ERG13基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：11所示；tHMG1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；ERG12基因的核苷酸序列如SEQID NO：13所示；ERG8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；MVD1基因的核苷酸序列如SEQID NO：15所示；IDI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。

在本发明的一个或多个实施例中，所述的微生物底盘细胞为真核细胞或原核细胞；优选地，所述微生物底盘细胞为米曲霉、大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、芽孢杆菌、构巢曲霉、黑曲霉、粗糙脉孢菌、交链格孢菌或镰刀菌；更优选地，所述底盘细胞为米曲霉。