[发明专利]一种高效快速制备双链cDNA的方法

权利要求书

1.一种高效制备双链cDNA的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

a)逆转录：以制备获得的总RNA为模板，进行逆转录，获得cDNA的第一链；

b)cDNA第二链的合成：采用二链合成反应液和含DNA聚合酶的二链合成酶mix，以逆转录合成的cDNA第一链为模板，合成cDNA的第二链，所述合成步骤适用小体积反应体系；

c)纯化得到双链cDNA；

其中所述步骤b)中二链合成酶mix包括以下的一种或多种：DNA聚合酶I、SequenaseV2.0 DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、RNaseH、T4 DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶；所述DNA聚合酶I优选Klenow大片段DNA聚合酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)中二链合成反应液包含Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺中的一种或多种；以及包含Tris-HCl、3(N吗啉)丙磺酸、柠檬酸钠中的一种或多种；DTT；KCl和dNTP。

3.一种宏转录组二代测序方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)采集临床患者样本；

2)总RNA提取：提取样本的总DNA/RNA，核酸酶孵育去除DNA，获得样本总RNA；

3)逆转录：配制逆转录反应体系，包括模板RNA、逆转录buffer和随机引物，以及逆转录酶，获得cDNA第一链；

4)cDNA第二链的合成：包含逆转录合成的cDNA产物与二链反应液、含DNA聚合酶的二链合成酶mix，以逆转录合成的cDNA第一链为模板，合成cDNA的第二链，得到双链cDNA；

5)双链cDNA纯化；

6)文库构建：采用转座酶建库方法，纯化后的文库用生物分析仪进行分析；

7)文库定量和Pooling；

8)高通量测序和生物信息学分析；

其中所述步骤4)中二链合成酶mix包括以下的一种或多种：DNA聚合酶I、SequenaseV2.0 DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、RNaseH、T4 DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶；所述DNA聚合酶I优选Klenow大片段DNA聚合酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述步骤4)中二链合成反应液包含Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺中的一种或多种；以及包含Tris-HCl、3(N吗啉)丙磺酸、柠檬酸钠中的一种或多种；DTT；KCl和dNTP。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述二链合成酶mix包含Sequenase V2.0DNA聚合酶和RNaseH；所述二链合成反应液包含Tris-HCl缓冲液、MgCl₂、DTT。

6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述逆转录步骤和cDNA第二链的合成步骤的试剂分别预制成混合液用于相应合成步骤。

7.根据权利要求3-6任一项所述的方法，其中所述临床样本来自人或动物的脑脊液、血液、肺泡灌洗液、鼻咽分泌物/抽提物、痰液或脓肿组织。

8.根据权利要求3-6任一项所述的方法，其中所述测序步骤采用Nextseq CN500测序，测序方式为SE75，SE150或PE150，优选SE75。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述逆转录步骤中，逆转录酶选自ThemoFisher的SuperScirpt III逆转录酶、Takara逆转录酶或Ultra^TMIIRNA First Strand Synthesis Module E7771；优选SuperScirpt III逆转录酶和Ultra^TMII RNA First Strand Synthesis Module E7771。