[发明专利]一种高效快速制备双链cDNA的方法

说明书

本发明公开了一种高效快速的由RNA制备双链cDNA的方法，用于二代测序技术对临床样本的宏转录组分析。宏转录组分析是在RNA水平上对病原体进行检测，可检测临床样本中RNA病毒和有转录活性的DNA病原体，对临床样本病原体的检测非常重要。宏转录组分析流程包括以下几个部分：总RNA提取，逆转录和二链cDNA合成，文库制备，文库定量和上机、数据分析和报告解读。本发明优化了宏转录组分析的RNA逆转录和二链cDNA合成方法，采用转座酶进行文库构建，RNA文库构建在4小时内完成，RNA逆转录和二链cDNA合成从原来的2‑3小时缩短到1小时内完成，病原体检测效率提高，病原体检出序列数提高2‑4倍。

技术领域

本发明涉及一种高效快速制备双链cDNA的方法，可用于二代测序技术临床样本的宏转录组分析。

背景技术

感染性疾病是当今世界威胁人类健康的重点疾病。病原呈现多样化和复杂化的发展趋势，各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明原因的发热，都给人类健康带来巨大的威胁，因此，临床上对感染性疾病检测的准确性和时效性提出了更高的要求。

传统的病原体检测方法有两种：一种是基于培养的方法，是鉴定病原微生物的金标准，这种方法依赖于样本，且对试验和技术条件十分严格，限制其广泛应用；另一种是基于特异性引物、探针、抗体的方法，如抗原抗体反应、PCR反应等特异性快速检测系统，这种方法只能检测已知的病原体，无法应对未知及人工改造的病原体。

宏基因组下一代测序(mNGS)技术直接针对标本中核酸无偏倚检测病原微生物序列。和传统检测不同，宏基因组检测灵敏度高，准确度高，对不明原因危急重感染、新发突发传染病的病原学诊断具有独特价值。

宏基因组测序是在DNA水平，而宏转录组测序是在RNA水平检测病原体。相比宏基因组测序不能区分DNA来源于有生命或无生命的生物体，宏转录组测序能鉴定RNA病毒和有转录活性的微生物。和宏基因组相比，宏转录组样品制备较复杂，RNA提取后需要进行逆转录和二链合成，转化双链cDNA再进行建库，实验成本相对较高，实验周期长。

宏转录组流程主要包括以下流程：总RNA制备；逆转录和cDNA二链合成；文库构建；高通量二代测序和生物信息学分析。

宏转录组分析对样本的RNA纯度要求高，RNA提取后需严格去除DNA污染，而后经过逆转录和二链合成，转化为cDNA双链后方可进行文库构建。RNA建库商品化试剂盒有NEB公司Ultra II RNA Library Prep Kit、Nugen公司Ovation RNAseq v2 kit、Epicentre公司Script Seq v2 RNA-seq kit等。NEB公司的Ultra II RNALibrary Prep Kit逆转录和二链合成的反应时间长，需2-3小时完成；逆转录和二链合成后采用常规建库方法进行建库，RNA建库实验周期长。Nugen公司Ovation RNAseq v2 kit逆转录和二链合成也需要2-3小时完成，Epicentre公司的产品Script Seq v2 RNA-seq kit和将逆转录和建库同时进行，建库时间短，但对RNA起始量需要0.5ng，对宏转录微量样本不适用。

和常规RNA建库不同，针对病原微生物宏转录组分析，临床样本如脑脊液、血液等提取的RNA浓度非常低，另外宏转录组RNA建库要求的实验周期短。如上所述现有技术中类似产品，存在cDNA合成时间长，建库时间长，或难以构建小反应体系、对宏转录组微量样本不适用等缺点。因此，急需高效和快速的逆转录和二链合成体系，以及适合微量样本的cDNA合成体系，满足宏转录组的微量RNA建库需求。

发明内容

除非另有规定，本文中使用的所有技术和术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。除非特别说明，本文应用和涵盖的技术是本发明所属技术领域的技术人员熟知的标准方法。所述材料、方法和实施例仅用作说明目的，而不以任何方式限制本发明的保护范围。