[发明专利]一种荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子标记选择方法

权利要求书

1.一种荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子标记选择方法，其特征在于：包括以下步骤，

1)选取56头荷斯坦奶牛，人工采精各1.5ml，测定精液品质数据，并采用常规酚、氯仿法提取精子DNA，电泳及测定OD260/280法检测DNA质量；

2)根据GenBank序列NC_037350.1，利用Primer Premier 5软件设计一对特异性引物，PCR扩增荷斯坦奶牛miR-6531前体区域序列，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色检测扩增结果；

3)荷斯坦奶牛miR-6531前体区域73位点存在一个T→C突变，产生一个BspE I酶切位点，利用BspE I限制性内切酶，对所述的扩增产物进行酶切，采用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像系统拍照，将获得427bp片段的定义为TT型，获得427bp、250bp、177bp三个片段的定义为TC型，获得250bp、177bp两个片段的定义为CC型；

4)采用单因素方差分析比较不同基因型间各精液品质指标的差异，结果表明CC型奶牛个体的精液品质显著高于TT型，选择CC型和TC型个体留种。

2.根据权利要求1所述的一种荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子标记选择方法，其特征在于：所述56头荷斯坦奶牛及其精液品质数据均由山东省奥克斯种业有限公司提供，所述精液品质数据包括采精量、鲜精活力、精子密度和精子畸形率。

3.根据权利要求1所述的一种荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子标记选择方法，其特征在于：所述步骤2)中特异性引物序列为

P1：GCAGAGCGTGTCTTAGTTA(SEQ ID NO.1)，

P2：CCGTCAGGTACTCCAACA(SEQ ID NO.2)。

4.根据权利要求1所述的一种荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子标记选择方法，其特征在于：所述miR-6531前体区73T/C多态位点是根据牛SNP公共数据库(http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables；Bos_taurus_UMD3.1.1；SNP14)并利用miRNAQTLsnp软件筛选得到。

5.根据权利要求1所述的一种荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子标记选择方法，其特征在于：所述步骤3)中，BspEI酶切位点为TCTGGA→TCCGGA，所述BspEI限制性内切酶购买自ThermoFisher公司，所述凝胶成像系统型号为Tanon 3500，购买自上海天能公司。

6.根据权利要求1所述的一种荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子标记选择方法，其特征在于：所述miR-6531前体区域序列，序列NC_037350.1，76964883-76965460bp。

7.根据权利要求1所述的一种荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子标记选择方法，其特征在于：所述PCR反应总体系20μL，模板DNA50-100ng，2xTaq聚合酶Mix 10μL，引物各0.5μL，加灭菌双蒸水至20μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。

8.根据权利要求1所述的一种荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子标记选择方法，其特征在于：所述酶切反应体系20μL，PCR产物5μL，10U/μL BspE I酶0.5μL，10×缓冲液2μL，灭菌双蒸水12.5μL；55℃酶切3h。

9.根据权利要求1所述的一种荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子标记选择方法，其特征在于：所述荷斯坦奶牛不同miR-6531基因型间各精液品质差异显著性分析，采用SPSS 10中的One-way ANOVA方法进行。

10.根据权利要求1所述的一种荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子标记选择方法，其特征在于：包含权利要求1～7所述的分子标记、检测方法但不仅限于此种方法。